蒲公英内生真菌生物学特性及活性物质的研究

论文摘要

药用植物内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似活性的药用成分，近年来已经成为筛选新型、高效、广谱、抗菌活性物质的重要微生物来源。本研究从25株蒲公英内生真菌中筛选得到1株高效、广谱抑制病原菌的内生真菌PG23，对其进行了系统的研究。对PG23采用形态学观察和核糖体ITS-5.8s rDNA序列分析相结合进行其分类学鉴定。表明：高抑菌性菌株PG23属于子囊菌门（Ascomycota）、腔菌纲（Leculoascomycetes）、座囊菌目（Dothideales）、座囊菌科（Dothideales）、茎点霉属（phoma sacc.）真菌。对PG23的生化特性研究表明：该菌具有凝乳和利用硝酸盐的能力。以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示菌对蒲公英内生真菌PG23产抗菌物质的发酵培养基进行优化，优化后的最佳的培养基的组成分别为：马铃薯浸汁为基础，添加葡萄糖2.5%，大豆油0.5%，玉米粉0.15%，蒲公英汁8%，优化后抑制大肠杆菌抑菌圈直径达到26.7mm与优化前相比提高了22.47%；以马铃薯浸汁为基础，添加葡萄糖2.65%，豆油0.53%、玉米粉0.10%、蒲公英汁为7.06%，优化后抑金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到40.0mm与优化前相比提高了77.8%。优化后最佳的发酵条件是：装液量为45mL/250mL、初始pH为6.5、最适温度为26℃、菌种接种量为10%、摇床转速为160r/min。对蒲公英内生真菌PG23产抗菌物质进行了研究。1.抗菌活性物质在30℃100℃范围内具有良好的热稳定性；2.抑菌活性物质在pH17对G-大肠杆菌有良好的抑菌效果，在pH111对G+金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，同时，对嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等鱼类病原菌也具有高的抑制活性；3.活性物质具有消除β-内酰胺酶耐药大肠杆菌质粒的作用；4.经化学成分鉴别初步证实：活性成分主要为酚类、还原糖类和有机酸类物质；5.对活性抑菌物质连续萃取表明：抑菌物质的极性主要分布在乙酸乙酯的萃取相、正丁醇的萃取相和萃余相中；6.采用薄层层析和硅胶柱层析对乙酸乙酯相抑菌活性物质进行分离，得到活性物质的粗结晶；7.通过气质联用分析结晶产物的成分，主要为间甲基苯酚、邻甲基水杨酸甲酯、2-氢，3-甲基，3-甲酸甲酯苯并噻吩3个化合物；8.对比内生真菌发酵液乙酸乙酯萃取相和蒲公英浸汁的乙酸乙酯萃取相的化学成分分析，发现二者没有极性相似的化合物。分离鉴定的蒲公英内生真菌PG23具有耐热性、耐酸碱性、广谱抗菌特性。目前，分离得到PG23产间甲基苯酚、邻甲基水杨酸甲酯、2-氢，3-甲基，3-甲酸甲酯苯并噻吩3种抑菌活性物质。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 目的与研究意义
• 1.2 课题相关背景介绍
• 1.2.1 植物内生菌
• 1.2.2 常见的植物内生真菌种类与繁殖特性
• 1.2.3 内生真菌产与寄主植物相同或相似生物活性物质的理论基础
• 1.3 国内外研究进展
• 1.3.1 蒲公英内生真菌的研究现状与进展
• 1.3.2 内生真菌的形态学及种属鉴定
• 1.3.3 细菌耐药性机制及中草药消除耐药性质粒
• 1.3.4 内生真菌产抗菌活性物质研究进展
• 1.3.5 内生真菌活性物质的分离纯化
• 1.3.6 活性成分的结构解析
• 1.4 选题依据及论文设计思路
• 第二章 内生真菌生物学特性的研究
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基及主要溶液的配制
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 内生真菌的活化
• 2.2.2 内生真菌的形态学鉴定
• 2.2.3 内生真菌的分子生物学鉴定
• 2.2.4 内生真菌生理生化测定试验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 内生真菌形态学观察
• 2.3.2 内生真菌基因组 DNA 提取
• 2.3.3 PG23 ITS 片段 PCR 扩增结果
• 2.3.4 PCR 扩增产物切胶回收纯化检测电泳图
• 2.3.5 重组质粒鉴定
• 2.3.6 rDNA-ITS 序列测序
• 2.3.7 系统发育树的构建
• 2.3.8 内生真菌生理生化特性
• 2.4 讨论
• 第三章 内生真菌发酵条件的研究
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 供试菌种与指示菌种
• 3.1.2 主要培养基的配制
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 主要试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 孢子悬液制备
• 3.2.2 发酵培养
• 3.2.3 抑菌实验
• 3.2.4 培养基单因素试验
• 3.2.5 响应面分析法优化各因素最佳水平
• 3.2.6 蒲公英内生真菌发酵条件优化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 碳源及其最佳水平的选择
• 3.3.2 氮源及其最佳水平的选择
• 3.3.3 蒲公英浸汁比例优化结果分析
• 3.3.4 响应面分析法确定各因子的最佳水平
• 3.3.5 最优培养基的确定
• 3.3.6 发酵条件优化结果分析
• 3.4 讨论
• 第四章 蒲公英内生真菌菌株活性物质研究
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 实验药品及主要试剂的配制
• 4.2 主要仪器设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 发酵液的制备
• 4.3.2 抑菌活性物质的特性初步研究
• 4.3.3 抑菌活性物质成分的鉴定
• 4.3.4 抗菌物质的初步分离
• 4.3.5 乙酸乙酯提取物的硅胶柱层析
• 4.3.6 气质联用（GC-MS）结构分析
• 4.3.7 蒲公英内生菌发酵产物与宿主植物成分相似性研究
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 抑菌活性物质的特性
• 4.4.2 发酵液抑菌活性成分的初步鉴定
• 4.4.3 抑菌活性成分的极性分离
• 4.4.4 乙酸乙酯相活性物质的硅胶柱层析
• 4.4.5 结晶产物气质联用（GC-MS）分离和结构解析
• 4.4.6 蒲公英内生真菌发酵液中有效活性物质与宿主植物有效成分相似性的研究
• 4.5 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历