副猪嗜血杆菌基因表达文库的构建和新基因的挖掘

论文摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）是一种无运动性，多形态革兰氏阴性杆状细菌，属于巴斯德氏菌科。该菌是革兰瑟氏病的致病因子，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征；由于高发病率和死亡率，该病给全球的养猪业造成了巨大的经济损失。目前，人们对副猪嗜血杆菌的研究尚处于起始阶段，特别是分子水平的研究刚起步，公开报道的基因数不到20个。本研究旨在建立副猪嗜血杆菌血清5型地方株的基因组表达文库，为发掘副猪嗜血杆菌血清5型地方株新的功能基因奠定基础。选择我国流行优势菌株副猪嗜血杆菌血清5型地方株为研究对象，提取细菌基因组DNA，用限制性内切酶Sau3AⅠ对基因组DNA进行部分酶切，回收大小为1～5Kb的DNA片段，将其连接入原核表达载体pET-28a-c，最后转化宿主菌，结果成功地构建了基因表达文库，为后续的基因筛选工作奠定基础；另外，本研究选择嗜血杆菌属的流感嗜血杆菌为参考对象进行引物的设计，以副猪嗜血杆菌血清5型地方菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，结果表明成功地获得两个新基因：23S rRNA基因（存在于核糖体大亚基中的保守性基因）和腺苷酸环化酶基因（负责将腺嘌呤核苷三磷酸转变为环腺苷酸），并进一步做了不同物种之间的分子系统发育分析，构建了基于23S rRNA基因的邻接法系统发育树，阐明了副猪嗜血杆菌与其它菌种的分子进化关系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbreviation）
• 第1章 文献综述
• 1.1 副猪嗜血杆菌研究现状
• 1.1.1 病原学研究
• 1.1.2 致病性研究
• 1.1.3 分子水平研究
• 1.1.4 防治研究
• 1.2 细菌中的腺苷酸环化酶研究现状
• 第2章 研究目的和意义
• 第3章 副猪嗜血杆菌基因表达文库的构建
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 试验菌株
• 3.1.2 试验质粒
• 3.1.3 试验中的工具酶
• 3.1.4 试剂盒
• 3.1.5 主要试剂
• 3.1.6 培养基的制备
• 3.1.7 主要溶液的配制
• 3.1.8 主要器材
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 细菌染色体 DNA的大量制备
• 3.2.2 基因组酶切
• 3.2.3 基因组 DNA的回收
• 3.2.4 碱裂解变性法制备质粒
• 3.2.5 质粒的去磷酸化处理
• 3.2.6 转化实验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 基因组部分消化结果
• 3.3.2 文库载体的制备
• 3.3.3 质粒的酶切鉴定
• 3.3.4 转化子数的统计及评估
• 3.4 讨论
• 第4章 副猪嗜血杆菌新基因的挖掘及分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 试验菌株
• 4.1.2 试验的工具酶和质粒
• 4.1.3 试验的引物及设计
• 4.1.4 试验的主要试剂和试剂盒
• 4.1.5 培养基的制备
• 4.1.6 主要溶液的配制
• 4.1.7 主要器材
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细菌基因组 DNA的制备
• 4.2.2 聚合酶链式反应
• 4.2.3 扩增产物的回收与纯化
• 4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 4.2.5 连接产物的转化
• 4.2.6 质粒的制备
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 聚合酶链式反应结果
• 4.3.2 质粒提取与鉴定结果
• 4.3.3 基因序列及分析
• 4.3.3.1 基因的序列
• 4.3.3.2 序列的初步分析
• 4.3.3.3 腺苷酸环化酶基因结构分析
• 4.3.3.4 系统发育树的构建结果
• 4.4 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录