青蒿琥酯增强小鼠腹腔巨噬细胞内化清除内毒素、大肠埃希菌的作用及其机制研究

论文摘要

脓毒症（sepsis）是严重烧伤、创伤、感染、休克和大手术等后常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官系统功能障碍综合征（multiple organ dysfuctionsyndrome, MODS），是临床危重患者的主要死亡原因之一，病死率高达50%-80%，目前尚无有效的治疗手段。脂多糖/内毒素（lipopolysaccharide/endotoxin, LPS）是革兰阴性菌外膜的主要成分，是导致脓毒症（sepsis）的主要致病因子。LPS可通过与TOLL样受体4（Toll-like receptors4, TLR4）、清道夫受体（scavenger receptor, SR）等模式识别受体结合后内化入胞实现LPS的降解清除，并激活单核/吞噬细胞系统，诱导NF-κB、MAPK信号转导通路的的活化，引起过度的炎症反应从而诱导脓毒症的发生。单核/吞噬细胞系统可识别、内化LPS，也可直接吞噬、消化细菌。寻找拮抗LPS的药物是世界各国科学家们研究的热点。青蒿琥酯（artesunate, AS）为青蒿素的水溶性衍生物，在抗疟、抗肿瘤、调节免疫力等方面有广泛应用。本课题组前期研究发现青蒿琥酯可通过降低血清LPS水平保护脓毒症模型小鼠，并可明显降低热灭活大肠埃希菌攻击脓毒症模型小鼠死亡率，但体外实验发现青蒿琥酯并不能直接结合、中和LPS。因此，我们推测青蒿琥酯保护脓毒症模型小鼠、降低血清LPS水平的机制可能与其增加单核/吞噬细胞系统的内化清除能力有关。目的以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探讨青蒿琥酯对小鼠腹腔巨噬细胞内化清除LPS、大肠埃希菌能力的影响及其可能机制。方法1.青蒿琥酯增强小鼠腹腔巨噬细胞内化清除内毒素、大肠埃希菌的的作用研究⑴小鼠腹腔巨噬细胞的分离、培养与鉴定。⑵应用激光共聚焦显微镜观察青蒿琥酯、网格蛋白抑制剂MDC、内体酸化抑制剂氯喹对小鼠腹腔巨噬细胞内化FITC-LPS的影响。⑶应用激光共聚焦显微镜和菌落集落形成记数实验观察青蒿琥酯对小鼠腹腔巨噬细胞内化清除大肠埃希菌的影响。2.青蒿琥酯增强小鼠腹腔巨噬细胞内化清除内毒素、大肠埃希菌的作用机制研究⑴应用ELISA法观察青蒿琥酯、MDC、氯喹处理对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6释放的影响。⑵应用RT-PCR技术检测小鼠腹腔巨噬细胞经青蒿琥酯、LPS处理前后、TLR4、SRs mRNA以及AOAH mRNA表达的变化。⑶应用FAM技术检测青蒿琥酯对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞膜上TLR4、SRs受体表达的影响。结果1.青蒿琥酯增强小鼠腹腔巨噬细胞内化清除内毒素、大肠埃希菌的的作用研究⑴成功分离了小鼠腹腔巨噬细胞，且细胞纯度、活力符合实验要求。⑵青蒿琥酯能够增加小鼠腹腔巨噬细胞对LPS的内化，且在MDC、氯喹存在的情况下仍可增加小鼠腹腔巨噬细胞对LPS的内化。⑶青蒿琥酯能够增加小鼠腹腔巨噬细胞对大肠埃希菌的内化与清除。2.青蒿琥酯增强小鼠腹腔巨噬细胞内化清除内毒素、大肠埃希菌的作用机制研究⑴小鼠腹腔巨噬细胞分别经青蒿琥酯、MDC、氯喹处理后，LPS刺激所致的TNF-α、IL-6释放被显著抑制；且青蒿琥酯与MDC、氯喹共同作用可进一步增强这种抑制作用。⑵青蒿琥酯对小鼠腹腔巨噬细胞TLR4、SR-A、MARCO、SR-BⅠ及AOAH mRNA的表达均有影响。⑶青蒿琥酯不影响小鼠腹腔巨噬细胞胞膜上TLR4、SRs的表达。结论1.青蒿琥酯能够增强小鼠腹腔巨噬细胞内化LPS的能力，且在网格蛋白抑制剂、内体酸化抑制剂存在的情况下仍可增强小鼠腹腔巨噬细胞内化LPS的能力。2.青蒿琥酯能够增加小鼠腹腔巨噬细胞对大肠埃希菌的内化与清除。3.青蒿琥酯增加小鼠腹腔巨噬细胞内化清除LPS、大肠埃希菌能力的机制与其影响MyD88依赖和非依赖信号转导通路和TLR4、SRsmRNA表达有关；与影响网格蛋白功能、内体酸化和小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR4、SR-A、SR-BⅠ的表达以及AOAH表达无关。

论文目录

• 中英文缩略语对照表
• Abstract
• 中文摘要
• 前言
• 第一部分 青蒿琥酯增强小鼠腹腔巨噬细胞内化清除内毒素、大肠埃希菌的的作用研究
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第二部分 青蒿琥酯增强小鼠腹腔巨噬细胞内化清除内毒素、大肠埃希菌的作用机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 全文讨论
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 内毒素识别、内化及清除相关受体的研究进展
• 参考文献
• 硕士研究生期间撰写论文