nsdB，天蓝色链霉菌中一个负调控抗生素产量的基因功能的研究

论文摘要

nsdA基因最初是由本实验室发现，该基因对链霉菌分化有负调控作用。根据天蓝色链霉菌全基因组序列，运用Blast方法检索分析发现基因SCO7252和SCO1593与之有高度的同源性，并且这三个基因的蛋白产物中都含有一个类TPR结构。本研究于是进行了一系列的实验来检测基因SCO7252和SCO1593的生物学功能。首先运用PCR-targeting的方法分别构建了基因SCO7252和SCO1593的中断载体，通过接合转移的方法将它们导入天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）A3（2）的M145菌株中，成功地将基因SCO7252和SCO1593进行了中断并分别筛选到三株双交换菌株。在MS平板上分别观察两个基因中断菌株的表型，观察发现SCO7252中断菌株的放线紫红素和钙依赖抗生素产量较之野生型M145增多，但在形态分化方面没有区别；SCO1593表型与野生型M145菌株相比没有很明显的不同。因为基因SCO7252中断菌株ZL2表型与基因nsdA中断菌株LW9的产素量都提高，我们依照nsdA的命名方法命名SCO7252为nsdB。RT-PCR结果显示nsdB基因与基因nsdA相似，也在培养30h后开始表达。为了研究这两个基因间的相互关系，本研究又分别构建了能在LW9中使用的含完整的nsdB互补序列的单拷贝和多拷贝质粒载体，以及能在ZL2中使用的含完整的nsdA互补序列的单拷贝和多拷贝质粒载体。将载体分别导入LW9和ZL2中，在MS上观察表型发现菌株LW9中引入含nsdB基因完整互补片断的高拷贝质粒pHL424后其表型能恢复到野生型水平。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 1 文献综述
• 1.1 链霉菌简介
• 1.2 链霉菌分化发育生物学
• 1.3 抗生素合成途径
• 1.4 课题相关背景介绍
• 1.5 本研究的工作基础、目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.2 引物
• 2.3 培养基和化学试剂
• 2.4 抗生素及其使用浓度
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 链霉菌培养及菌种保藏
• 2.5.2 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA
• 2.5.3 DNA溶液中蛋白质及RNA的去除
• 2法）及转化'>2.5.4 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl₂法）及转化
• 2.5.5 PCR-Targeting技术中大肠杆菌电转化感受态制备及电转化
• 2.5.6 DNA片段凝胶回收
• 2.5.7 载体的去磷酸化
• 2.5.8 酶连反应
• 2.5.9 大肠杆菌质粒的快速检测
• 2.5.10 PCR及相关技术
• 2.5.11 质粒从大肠杆菌向链霉菌的两亲本接合转移
• 2.5.12 链霉菌总DNA的提取
• 2.5.13 Southern杂交
• 2.5.14 天蓝色链霉菌钙依赖抗生素
• 2.5.15 RNA基本操作
• 3 结果与分析
• 3.1 PCR-Targeting技术基本原理
• 3.2 基因SCO1593功能的研究
• 3.2.1 基因SCO1593简介
• 3.2.2 基因SCO1593中断质粒的构建
• 3.2.3 天蓝色链霉菌A3（2）M145菌株中SCO1593基因的中断
• 3.3 基因nsdB功能的研究
• 3.3.1 基因nsdB简介
• 3.3.2 基因nsdB中断质粒的构建
• 3.3.3 天蓝色链霉菌A3（2）M145菌株中nsdB基因的中断
• 3.3.4 nsdB基因互补质粒pHL422的构建
• 3.3.5 nsdB基因中断菌株及互补菌株放线紫红素产量的检测
• 3.3.6 nsdB基因中断菌株及互补菌株CDA产量的检测
• 3.3.7 用RT-PCR检测不同时间nsdB表达的规律
• 3.3.8 nsdA和nsdB基因间的相互作用
• 3.3.9 将nsdB基因引入nsdA基因中断菌株LW9的载体构建
• 3.3.10 基因间相互作用菌株表型观察
• 3.3.11 RT-PCR分析两个基因间的关系
• 3.4 含类TPR结构的蛋白的生物信息学分析
• 4 总结与展望
• 4.1 总结
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢