丝素微球的制备及其作为细胞载体的研究

论文摘要

高分子载体的制备一直是组织工程或组织再生领域的研究热点。丝素作为一种天然蛋白质,具有优良的理化性能,良好的细胞相容性和组织相容性,并有利于保持生物大分子的活性。若能采用物理加工技术,制得受制备过程造成的化学污染程度轻、结构可控、能使生物活性物质缓慢释放的丝素蛋白微球,则将有可能为细胞扩增、细胞生长因子的控制释放及组织工程等领域提供一种新的高性能载体。本文用静电场分化、冷冻干燥与诱导丝素结构转变相结合的技术制备直径可控的多孔丝素微球,研究制备条件与微球结构之间的关系,并研究其作为细胞培养载体以及细胞生长因子缓释载体时所表现出的特性。用静电场将丝素溶液分化成液滴,经液氮凝固、冷冻干燥过程,同时分别用乙醇处理法和在丝素溶液中添加甘油的方法促进丝素蛋白结构转变,制备出直径为微米级的多孔丝素微球。用扫描电镜（SEM）观察了丝素溶液的浓度、电压、溶液的推注速度、针头直径对微球大小及形貌的影响,用X-射线衍射（XRD）、红外光谱（FTIR）等手段研究了丝素微球的聚集态结构。结果表明,微球的直径随着丝素溶液浓度的增大、溶液推注速度的升高、针头直径的增加而增大,随着电压的升高则明显较小。经乙醇处理后,微球的结晶结构向SilkⅡ发生转变；添加甘油的丝素微球,其分子构象主要表现为SilkⅡ结构,同时含有少量SilkⅠ结构。通过体外细胞培养,研究了L929细胞在直径不同的丝素微球上的生长情况。激光共聚焦显微镜（LSCM）和扫描电镜（SEM）观察结果表明,L929细胞能够在丝素微球的表面紧密粘附、充分伸展、形态正常,相互之间连接紧密,细胞数量随时间的延长而逐渐增多。细胞数量和MTT定量检测结果显示,直径较小（200-300μm）的微球,其比表面积更大,更有利于细胞的粘附和增殖；细胞数量在丝素微球表面呈现持续增长的趋势,扩增速度与普通培养板相比有极显著的差异。采用渗透-吸附法、化学交联法和直接包埋法制备了装载碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的丝素微球,ELISA测定了微球的载药率、包埋率及体外释药率。结果显示,三种方法均能获得包埋率达97%以上的bFGF-丝素微球。体外释放实验表明,渗透-吸附法制备的微球,大部分bFGF在4h内释放,但仍有约17%的bFGF能在4-48h内缓慢释放。化学交联法和直接包埋法制备的微球具有相对缓慢的释药速率,13d后仍有约50%的bFGF剩余。将bFGF-丝素微球用作细胞培养载体,激光共聚焦显微镜（LSCM）观察结果表明,bFGF-丝素微球能够支持L929细胞的粘附、生长与增殖。MTT结果显示细胞在bFGF-丝素微球上的增殖情况明显优于未装载生长因子的微球,丝素蛋白微球作为bFGF的载体,对保持bFGF的活性有明显的作用。本文用物理方法制备的丝素蛋白多孔微球,可以作为细胞扩增及生物活性物质的控制释放载体,为生物医学领域提供了一种性能优良的新材料,开发、应用前景广阔。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 高分子微球概述
• 1.2 高分子微球的制备方法
• 1.3 高分子微球作为细胞培养载体及细胞生长因子缓释载体的研究进展
• 1.4 丝素蛋白的结构及其在生物医学领域的应用
• 1.5 丝素微球的研究进展
• 1.6 本文的研究目的和主要内容
• 第二章 丝素微球的制备
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 丝素微球的表面及内部形貌
• 2.2.2 工艺参数对丝素微球直径的影响
• 2.2.3 丝素微球的结构
• 2.3 本章结论
• 第三章 丝素微球作为细胞培养载体的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 细胞粘附率
• 3.2.2 扫描电镜
• 3.2.3 细胞增殖
• 3.3 本章结论
• 第四章 装载bFGF的丝素微球的特性
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 bFGF-丝素微球的载药释药性能
• 4.2.2 bFGF-丝素微球作为细胞培养载体的研究
• 4.3 本章结论
• 第五章 结语
• 5.1 全文结论
• 5.2 本文的主要研究成果
• 5.3 今后进一步的研究计划
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢