动物腹泻重组抗原基因的克隆与表达及植物疫苗载体的初步研究

论文摘要

新疆是我国的牧业大省,每年因幼畜腹泻造成的巨大的经济损失。长期以来,解决腹泻的主要办法就是药物治疗,但是,由于抗生素的不合理使用,使得动物耐药性增加。药物治疗的效果已不再理想,成为困扰养殖业的难题之一。因此,疫苗预防将是控制幼畜腹泻的发展趋势。引起动物幼畜腹泻主要原因是由于产肠毒素性大肠埃希氏菌（Enterotoxigenic E.coli, ETEC）和轮状病毒（Rotavirus,RV）感染引起的。在RV病毒的防治中,轮状病毒外壳蛋白VP4和VP7是主要保护性抗原,对疫苗研究具有重要作用。ETEC的致病因子包括黏附素（adhesin）和肠毒素（enterotoxin）,黏附素本身无毒,但是它可以与肠上皮细胞特异性受体结合,是实现ETEC的致病前提,ETEC定居后产生的肠毒素对肠上皮细胞具有毒性作用,从而引起细胞代谢紊乱,最终导致幼畜腹泻。因此针对于黏附素和肠毒素的疫苗,是当前ETEC重组疫苗研究的主要热点。利用转基因技术构建植物生物反应器,生产口服疫苗是目前新兴的研究领域。与其他疫苗生产方式相比,转基因植物口服疫苗生产技术具有高效、经济和简便等特点。根据转基因植物口服疫苗的特点,人和家畜家禽摄食方式的不同,应用转基因植物口服疫苗预防集约化饲养动物传染病的发生和流行,具有更为重要的意义。转基因植物口服疫苗的研究热点逐渐由人的转基因植物口服疫苗向家畜和家禽的转基因植物口服疫苗的方向转移。但目前植物可饲（食）疫苗的研究还处在刚刚起步阶段,还存在许多问题。除需要进一步提高抗原基因在植物中的表达量和稳定性以外,还需要解决增强转基因植物可饲（食）疫苗的免疫原性和克服口服耐性问题。添加免疫佐剂是提高免疫反应强度的有效方法,在非植物疫苗中已经被多次证实。对于植物疫苗,在抗原基因转入的同时加入免疫佐剂的基因,使转基因植物在表达抗原蛋白的同时也表达免疫佐剂,应是提高转基因植物口服疫苗免疫反应性的可行策略之一。LT不仅是一种有效的粘膜免疫原,而且也是一种良好的粘膜免疫佐剂。LT与多种非相关的蛋白或非蛋白抗原经不同的免疫途径共免疫,均能明显增强机体针对共服抗原的粘膜sIgA和IgG反应,同时还能消除机体对这些共免疫抗原的耐受,诱发针对它们的长期记忆。本研究首先是克隆了ETEC的黏附素基因K88ac,通过同源性比较,选择在基因的高度可变区,通过TP-PCR技术,将热稳定性肠毒素STII的抗原决定簇（CEHYRQIAKESCKKGF）与K88ac蛋白融合。以大肠杆菌热敏肠毒素LTB作为佐剂,用原核表达的K88ac-STⅡ抗原免疫小鼠能很好地产生针对K88ac-STⅡ的抗体,且能

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 转基因植物疫苗的研究进展
• 1.1.1 转基因植物疫苗的可行性
• 1.1.2 转基因植物疫苗的发展现状
• 1.1.3 植物口服疫苗存在的问题和研究策略
• 1.2 大肠杆菌热敏性肠毒素研究进展
• 1.2.1 LT 特性与分类
• 1.2.2 LT 分子生物学功能
• 1.2.3 LT 免疫原性研究
• 1.2.4 LT 的佐剂作用
• 1.2.5 LT 免疫原性应用
• 1.2.6 LT 佐剂作用的应用
• 1.3 本研究的目的意义、内容和技术路线
• 1.3.1 本项目研究的目的意义
• 1.3.2 本项目研究的主要内容
• 1.3.3 本项目研究的技术路线
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 菌株和质粒
• 2.1.4 工具酶及化学试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 多价保护性抗原基因的克隆
• 2.2.2 杂花苜蓿转基因再生体系的建立及遗传转化
• 2.2.3 类全毒素 LT 植物表达载体的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 多价保护性抗原基因的克隆
• 3.1.1 融合基因 STI-STII 的克隆和序列分析
• 3.1.2 K88ac-STII 嵌合基因
• 3.1.3 K88ac-STII 原核表达
• 3.1.4 融合蛋白的免疫原性测定
• 3.1.5 免疫各组小鼠抗体水平的检测
• 3.1.6 攻毒实验
• 3.1.7 轮状病毒多表位基因的重组
• 3.1.8 重组轮状病毒多表位基因（RE）的原核表达及免疫原性检测.
• 3.1.9 植物表达载体的构建及重组子的鉴定
• 3.1.10 部分转基因烟草的 ELISA 快速检测及表达效率的测定
• 3.2 杂花苜蓿转基因再生体系的建立及遗传转化
• 3.2.1 杂花苜蓿再生体系的建立
• 3.2.2 农杆菌侵染条件优化
• 3.2.3 杂花苜蓿对农杆菌的敏感性试验
• 3.2.4 抗氧化剂抑制农杆菌浸染外植体褐化的研究
• 3.2.5 农杆菌介导的杂花苜蓿的遗传转化
• 3.3 类全毒素 LT 植物表达载体的构建
• 3.3.1 LTA、LTB 基因的克隆
• 3.3.2 LTA、LTB 基因的原核表达
• 3.3.3 LTA-LTB/pCAMBIA2300 双价植物表达载体的构建
• 3.3.4 pBLG-UP 植物表达载体的构建
• 3.3.6 农杆菌 EH105 介导法转化烟草结果
• 3.3.7 LTA/LTB 全毒素装配定性检测结果
• 3.3.8 PR1a-STI-STII-LATA2/UP-LTB 植物表达载体的构建结果
• 3.3.9 PR1a-k88-STII-LATA2/UP-LTB 植物表达载体的构建
• 4. 讨论
• 4.1 杂花苜蓿转基因再生
• 4.1.1 植物生长调节剂在杂花苜蓿胚胎发生中作用
• 4.1.2 不同苗龄的杂花苜蓿下胚轴对胚性愈伤形成的影响
• 4.1.3 不同培养基成分对杂花苜蓿胚胎发生的影响
• 4.1.4 不同碳源对杂花苜蓿胚胎发生的影响
• 4.1.5 苜蓿转基因过程中的褐化问题
• 4.1.6 进一步研究设想
• 4.2 K88AC菌毛蛋白表面呈现半抗原热稳定肠毒素 STⅡ
• 4.2.1 K88ac 插入位点的选择
• 4.2.2 STII 抗原片段的选择
• 4.2.3 K88ac 呈现STII 抗原片段免疫效果
• 4.4 提高外源基因的表达策略
• 4.4.1 MAR 序列影响转基因表达的机制
• 4.4.2 提高植物表达重组蛋白的方法
• 4.5 LT 作为植物疫苗的载体
• 4.5.1 ST 与LTB 融合基因表达效果
• 4.5.2 LT 作为植物疫苗的载体优势
• 4.5.3 类全毒素嵌合载体的构建
• 5. 主要的结论与创新点
• 6. 参考文献
• 附录
• 英文缩写词表
• 致谢