枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶基因的克隆及表达

论文摘要

本论文主要研究了谷氨酰胺转胺酶基因在大肠杆菌中的表达,并将该基因转入枯草芽孢杆菌中,实现了该酶的分泌表达。对大肠杆菌BL21／pET-tg的诱导表达条件进行了优化,对纯化后的重组蛋白的酶学性质作了初步研究,以枯草芽孢杆菌DB104染色体DNA为模板,利用PCR技术成功地扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因（tg）,并与大肠杆菌载体pET-22b（+）相连,构建了重组表达质粒pET-tg。将重组表达质粒pET-tg转入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建重组菌BL21/pET-tg,重组菌经IPTG诱导表达出谷氨酰胺转胺酶。表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,酶活为1950U/g（DCW）。以重组质粒pET-tg为模板,PCR扩增谷氨酰胺转胺酶基因（tg）,将其与枯草芽孢杆菌质粒pWB980相连,构建了枯草芽孢杆菌重组表达质粒pWBTG。采用原生质体转化的方法将重组表达质粒pWBTG转入枯草芽孢杆菌DB104中,构建重组菌DB104/pWBTG,实现了该基因的分泌表达,培养24h后酶活达到318 U/g（DCW）。对大肠杆菌BL21/pET-tg的诱导条件进行了优化,结果为：当OD600为1.2左右时,添加IPTG至终浓度为0.2mmol/L,同时温度降至25℃开始诱导,诱导时间为5h。优化后产物绝大部分以可溶形式存在,酶活由1590U/g（DCW）提高到2200U/g（DCW）,比优化前提高了的38%。采用Ni2+亲和柱对重组菌BL21/pET-tg表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的谷氨酰胺转胺酶的酶学性质进行了初步研究,结果为：目的蛋白的最适反应温度为60℃；在75℃下可以保持稳定性,超过75℃酶活损失严重；最适pH值为8.0,在pH值7.0-9.0之间酶活较高；酶活不依赖Ca2+,但Ca2+对该酶具有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 概述
• 1.1.1 谷氨酰胺转胺酶
• 1.1.2 谷氨酰胺转胺酶的作用机理
• 1.1.3 谷氨酰胺转胺酶酶活测定方法
• 1.1.4 谷氨酰胺转胺酶的应用
• 1.1.5 产谷氨酰胺转胺酶菌株的选育
• 1.1.6 国内外研究进展
• 1.2 大肠杆菌表达系统
• 1.2.1 大肠杆菌表达系统的种类
• 1.2.2 目的蛋白的表达形式
• 1.2.3 包涵体形成的原因
• 1.2.4 减少包涵体形成的策略
• 1.3 枯草芽孢杆菌表达系统
• 1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统的特点
• 1.3.2 枯草芽孢杆菌常用的载体
• 1.3.3 外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达
• 1.4 本论文的立题依据和研究内容
• 1.4.1 立题依据
• 1.4.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要溶液
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 枯草芽孢杆菌DB104染色体DNA的提取
• 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.3 DNA纯度和浓度的测定
• 2.2.4 大肠杆菌表达载体pET-tg的构建
• 2.2.5 目的基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达
• 2.2.6 重组质粒pWBTG的构建及转化枯草芽孢杆菌DB104
• 2.2.7 目的基因在枯草芽孢杆菌DB104中的表达
• 2.2.8 大肠杆菌BL21/pET-tg培养条件的优化
• 2.2.9 重组蛋白的纯化
• 2.2.10 酶活测定
• 2.2.11 谷氨酰胺转胺酶酶学性质
• 3 结果与讨论
• 3.1 谷氨酰胺转胺酶基因在大肠杆菌中的表达
• 3.1.1 枯草芽孢杆菌DB104染色体DNA的提取
• 3.1.2 染色体DNA纯度和浓度的测定
• 3.1.3 PCR扩增目的基因
• 3.2 重组质粒pET-tg的构建及转化大肠杆菌JM109
• 3.2.1 pET-22b（+）质粒的特性
• 3.2.2 重组质粒pET-tg的构建
• 3.2.3 重组质粒pET-tg转化大肠杆菌JM109
• 3.2.4 重组质粒pET-tg转化大肠杆菌BL21（DE3）及目的基因的表达
• 3.3 谷氨酰胺转胺酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达
• 3.3.1 PCR扩增目的基因
• 3.3.2 重组质粒pWBTG的构建
• 3.3.3 重组质粒pWBTG转化枯草芽孢杆菌DB104
• 3.3.4 谷氨酰胺转胺酶基因的表达
• 3.4 大肠杆菌BL21/pET-tg培养条件的优化
• 3.4.1 诱导温度对目的产物表达的影响
• 3.4.2 诱导时机对目的产物表达的影响
• 3.4.3 诱导时间对目的产物表达的影响
• 3.4.4 IPTG浓度对表达的影响
• 3.5 谷氨酰胺转胺酶的纯化及酶学性质研究
• 3.5.1 谷氨酰胺转胺酶的纯化
• 3.5.2 谷氨酰胺转胺酶的酶学性质
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢