光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸中NADH的生理功能解析

论文摘要

本论文以一株丙酮酸工业化生产菌株Torulopsis glabrata CCTCC M202019为模型,从提升T. glabrata生产丙酮酸效率入手,借助代谢工程策略与生化工程方法,综合运用表达谱芯片、定量PCR （qPCR）、同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）、关键酶活性测定和代谢物分析等系统生物学方法,研究胞内NADH代谢方式,调控T. glabrata碳代谢流、影响基因转录与蛋白质（酶）表达水平以及增强对外界环境适应性的生理机制。主要研究结果如下:1)采用生化工程方法调节发酵培养基中综合表征其物理化学特性的氧化还原电位（ORP）,解析ORP水平调控胞内NADH代谢,进而加快糖酵解速率和改变碳流分布的生理机制。在20%溶氧条件下,利用铁氰化钾将培养环境的氧化还原电位从200 mV调高到400 mV。较高的氧化还原电位激活了依赖NADH的膜结合的铁还原酶活性,从而使胞内NADH氧化途径从氧化磷酸化部分转向膜结合的铁还原酶途径,实现NADH非产能氧化。该NADH氧化策略显著提高了包括己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶在内的糖酵解关键酶基因表达水平及其酶活性,而同时由于胞内NADH水平的降低,削弱了依赖NADH的甘油和乙醇合成途径。当ORP水平为400 mV时,T. glabrate的比葡萄糖消耗速率、比丙酮酸合成速率和丙酮酸产率分别增加46%、82%和23%;2)将肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）编码NADH氧化酶基因nox、荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）的选择性氧化酶基因AOX1和施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）的亚磷酸脱氢酶基因PtxD分别过量表达于T. glabrata中,并借助增强型荧光蛋白的发光特征,确认成功构建了定位于不同亚细胞结构中的NAD+再生途径。在对数生长中期,过量表达NADH氧化酶和选择性氧化酶导致胞内NADH浓度分别下降55%和45%,而亚磷酸脱氢酶的过量表达导致NADH浓度增加11%。与对照菌株T. glabrata CON相比较,T. glabrata NOX和T. glabrata AOX的丙酮酸产量分别增加了13%、19%,丙酮酸产率分别增加了15%、21%,丙酮酸生产强度分别增加了22%、29%;而T. glabrata PtxD的丙酮酸产量、产率和生产强度分别降低了20%、17%和20%;3)借助表达谱芯片、qPCR、iTRAQ、关键酶活性测定等系统生物学策略,在基因转录、蛋白质表达、关键酶活性等层次系统阐释了不同亚细胞结构中NAD+水平对丙酮酸合成代谢途径（葡萄糖转运系统、糖酵解途径、磷酸戊糖途径和甘油合成途径）的影响。从调控不同亚细胞结构内NADH来看,降低胞质和线粒体NADH水平:（1）都显著上调CAGL0A01782g转录水平及其编码的己糖转运蛋白表达量,但是敲除CAGL0A01782g并不会降低T. glabrata CON、NOX和AOX糖酵解速率,说明CAGL0A01782g编码的葡萄糖转运蛋白不是控制糖酵解速率的关键因素;（2）都能有效诱导糖酵解途径,特别是磷酸果糖激酶基因转录上调及酶活性增加,但是降低线粒体NADH水平能更显著的增强糖酵解活性;（3）都对磷酸戊糖途径无显著影响。此外,降低胞质NADH导致3-磷酸甘油脱氢酶基因表达下调及其酶活性降低,但是降低线粒体NADH并没有对甘油途径基因表达水平产生影响;就调控细胞质内NADH水平而言,其对磷酸戊糖途径影响较小,而对其它丙酮酸合成相关途径影响的差异主要体现在,增加胞质内NADH水平:（1）对所有检测到的编码己糖转运蛋白基因转录没有影响;（2）下调了糖酵解关键酶基因和蛋白表达水平以及降低关键酶酶活性;（3）显著上调甘油合成途径中的编码3-磷酸甘油脱氢酶和甘油3-磷酸酶的基因表达,增强了3-磷酸甘油脱氢酶酶活性;4)调控不同亚细胞结构内NADH水平对三羧酸（TCA）循环途径基因转录、蛋白表达量、酶活性和TCA循环中间代谢物浓度均没有显著影响。增加硫胺素的补加量,NADH调控可以显著的改变TCA循环碳代谢流,表明亚适量硫胺素对丙酮酸脱氢酶的控制,是调控胞内NADH不能改变TCA循环活性的主要因素之一。对于乙醇合成途径:（1）降低胞质和线粒体NADH水平,均导致乙醇脱氢酶基因下调表达和乙醇脱氢酶酶活性下降,但加速线粒体NADH氧化更加显著地降低乙醇合成途径活性;（2）提高胞质内NADH水平,诱导了乙醇脱氢酶基因表达上调及其酶活性的增加;5)在阐明NADH及其代谢产物ATP响应碳源和氮源饥饿的生理机制的基础上,提出并实践可以增强T. glabrata适应饥饿环境能力的生化工程策略。碳源饥饿导致T. glabrata NOX平均代谢能力下降22%,而T. glabrata PtxD的平均代谢能力增加35% （在补加25 mM亚磷酸条件下）。氮源饥饿导致T. glabrata NOX平均代谢能力降低44%,而T. glabrata PtxD平均代谢能力增加23%。进一步发现碳/氮源饥饿T. glabrata的胞内ATP水平与其代谢能力正相关。依据上述研究结论,通过在营养饥饿后的发酵培养基中补加辅助性能量底物—柠檬酸,增加胞内ATP供给,加速了碳/氮源饥饿T. glabrata代谢能力恢复。这一结果表明,通过对NADH水平的调节,增加胞内能量,可以有效的增强T. glabrata应对碳/氮源饥饿的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 工业微生物中NADH 的代谢调控
• 1.2.2 NADH 调控对碳中心代谢途径的影响
• 1.3 本论文主要研究内容
• 1.3.1 调控胞内NADH 优化发酵过程中仍存在的问题
• 1.3.2 本论文的主要研究内容
• 第二章 高水平氧化还原电位加速T. glabrata 糖酵解速率
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 培养基及相关溶液
• 2.2.3 培养条件
• 2.2.4 ORP 的测量
• 2.2.5 代谢物分析方法
• 2.2.6 酶活性的测定
• 2.2.7 荧光定量PCR （qPCR）
• 2.3 结果
• 2.3.1 3-磷酸甘油醛脱氢酶不是控制糖酵解速率的因素
• 2.3.2 溶氧浓度对糖酵解速率和丙酮酸产率的影响
• 2.3.3 在低溶氧条件下，ORP 水平对核苷酸代谢的影响
• 2.3.4 在低溶氧条件下，高ORP 水平对糖酵解途径的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• +/H 再生系统的构建及其对丙酮酸发酵的影响'>第三章 异源NAD⁺/H 再生系统的构建及其对丙酮酸发酵的影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 培养基和丙酮酸发酵条件
• 3.2.3 质粒及重组菌株构建
• +/H 再生系统活性的测定'>3.2.4 NAD⁺/H 再生系统活性的测定
• 3.2.5 葡萄糖、有机酸、核酸类物质、细胞浓度、乙醇和甘油的测定
• 3.3 结果与讨论
• +/H 再生系统的构建与验证'>3.3.1 NAD⁺/H 再生系统的构建与验证
• +/H 再生系统在光滑球拟酵母细胞中的定位'>3.3.2 NAD⁺/H 再生系统在光滑球拟酵母细胞中的定位
• +/H 再生系统对丙酮酸发酵的影响'>3.3.3 NAD⁺/H 再生系统对丙酮酸发酵的影响
• +/H 再生系统对胞内核苷类物质的影响'>3.3.4 NAD⁺/H 再生系统对胞内核苷类物质的影响
• 3.4 本章小结
• +/H 再生系统对丙酮酸合成途径的影响'>第四章 异源NAD⁺/H 再生系统对丙酮酸合成途径的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 培养基及发酵条件
• 4.2.3 分子生物学操作
• 4.2.4 分析方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 表达谱芯片的转录组学分析
• 4.3.2 基于iTRAQ 的蛋白质组学分析
• +/H 再生系统对葡萄糖转运系统的影响'>4.3.3 异源NAD⁺/H 再生系统对葡萄糖转运系统的影响
• +/H 再生系统对糖酵解途径的影响'>4.3.4 异源NAD⁺/H 再生系统对糖酵解途径的影响
• +/H 再生系统对糖酵解分支途径的影响'>4.3.5 异源NAD⁺/H 再生系统对糖酵解分支途径的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 CAGL0A017829 编码的葡萄糖转运蛋白不是控制糖酵解速率的主要因素
• 4.4.2 不同亚细胞结构内NADH 调控对丙酮酸合成途径的影响
• 4.4.3 不同水平的NADH 对丙酮酸合成途径的影响
• 4.5 本章小结
• +/H 再生系统对丙酮酸分解途径的影响'>第五章 异源NAD⁺/H 再生系统对丙酮酸分解途径的影响
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 培养基和发酵条件
• 5.2.3 分析方法
• 5.3 结果
• +/H 再生系统对丙酮酸分解代谢途径基因表达的影响'>5.3.1 异源NAD⁺/H 再生系统对丙酮酸分解代谢途径基因表达的影响
• ++/H 再生系统对丙酮酸分解代谢途径蛋白表达量和酶活性的影响'>5.3.2 异源NAD⁺+/H 再生系统对丙酮酸分解代谢途径蛋白表达量和酶活性的影响
• +/H 再生系统对TCA 中间代谢物和氨基酸代谢的影响'>5.3.3 异源NAD⁺/H 再生系统对TCA 中间代谢物和氨基酸代谢的影响
• 5.3.4 增加外源硫胺素浓度对TCA 中间代谢物和氨基酸代谢的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第六章 高水平ATP 加速碳/氮源饥饿T. glabrata 恢复代谢能力
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 菌株
• 6.2.2 培养基
• 6.2.3 碳/氮源饥饿试验研究路线
• 6.2.4 补加柠檬酸的丙酮酸发酵试验
• 6.2.5 代谢物分析方法
• 6.3 结果
• 6.3.1 碳源/氮源饥饿对细胞代谢能力的影响
• 6.3.2 碳源/氮源饥饿对胞内ATP 浓度的影响
• 6.3.3 代谢能力与胞内ATP 浓度的关系
• 6.3.4 亚磷酸浓度对T. glabrata PtxD 胞内ATP 浓度和代谢能力的影响
• 6.3.5 补加柠檬酸加速营养饥饿T. glabrata CON 恢复代谢能力
• 6.4 讨论
• 6.5 本章小结
• 结论
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录I：作者在攻读博士学位期间发表的论文