丹酚酸抗氧化活性标识及对组织损伤保护作用

论文摘要

丹酚酸是一大类植物多酚化学物，在唇形科鼠尾草属（Salvia L.）植物中含量丰富。研究表明，丹酚酸在活血化瘀、增加冠脉血流量、抗动脉粥样硬化等方面有显著生物活性，对缺血和缺血再灌注引起的损伤有保护作用，丹酚酸的生物活性及功效已越来越受到人门的重视。但是，由于丹酚酸类物质种类多、结构相似而繁杂、数量消长缺乏规律性等原因，给这类物质的高通量活性筛选及作用机制研究带来了很大困难。氧化性损伤是导致所有血管相关性疾病共同的作用机制。基于对丹酚酸多羟基结构的分析，我们推测抗氧化活性可能是其具有多种生理作用的主要机制之一。本课题以丹酚酸为代表，对丹酚酸成分进行分离及表征，探讨丹酚酸的体内、体外的抗氧化能力，并利用高效液相色谱（HPLC）构建了植物多酚抗氧化活性高通量标识技术，对丹酚酸保护组织氧化性损伤的作用途径进行了初步探讨。为多酚类植物化学物高通量活性筛选研究提供了一种崭新的技术方法，为进一步研究丹酚酸对血管相关性疾病的作用机制奠定基础。目的：探讨丹酚酸抗氧化活性作用机制及其与组织氧化损伤保护之间的关系，构建植物多酚在线抗氧化活性高通量筛选技术，为研究丹酚酸对血管相关性疾病的作用机制奠定基础，并开拓植物化学物分析新方法。方法：选用丹酚酸含量丰富的鼠尾草属植物丹参为原料，采用溶剂萃取、大孔吸附树脂纯化等技术分离以获得不同种类和含量的丹酚酸，并以标准对照和高效液相色谱（HPLC）进行表征。采用清除二苯代苦味酰肼自由基（DPPH）自由基、还原能力、亚铁离子的螯合能力、对β-胡萝卜素的漂白能力以及邻啡罗啉（Phen）-Cu-AscA-H2O2-DNA体外化学发光体系5种体外抗氧化反应模型综合评价丹酚酸的抗氧化能力和对DNA氧化损伤的保护作用。在此基础上建立大鼠急性肝损伤模型，研究丹酚酸在体内对氧化损伤组织的保护作用。以HPLC为手段，通过引入DPPH有机自由基与丹酚酸发生在线清除反应，发展抗氧化活性标识技术；HPLC定量测定丹酚酸作为血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）的活性，研究活性氧（ROS）产生与丹酚酸生物活性的关系。结果：1．从鼠尾草植物丹参的根部获得3种不同组成和纯度的丹酚酸AE、EE和RE，得率分别为73.2％、3.6％、2.2％。各丹酚酸在4℃干燥条件下保存，性状稳定，粉末性良好。在本实验条件下，3种丹酚酸HPLC色谱图中呈现8个共有峰，其中3个为标准对照丹参素（DSS）、咖啡酸（CA）、丹酚酸B（Sal B）所确认，Sal B含量分别为5.60％、74.38％和90.45％。丹酚酸水溶液在80℃和90℃下加热120min后，和在60℃相同时间下的加热相比，Sal B的含量有较大幅度的下降（p＜0.05），但在pH3条件下的热处理组Sal B含量没有显著变化。2．在本实验采用的5种模型中，丹酚酸均表现出不同程度的抗氧化能力。丹酚酸AE、EE和RE在浓度为100μg／mL时对DPPH自由基的清除活性（％）分别为35.87±0.34、88.55±0.12、89.48±0.12；还原能力（以吸光度表示）分别为0.106±0.0015、0.7624±0.0053、0.8016±0.0076；对亚铁离子鳌合能力（％）分别为2.08±0.05、1.28±0.22、0.39±0.03；对β-胡萝卜素-亚油酸乳化液的漂白能力（％）分别为2.63±0.09、8.73±1.74、14.47±2.19；AE、EE、RE对DNA氧化损伤的保护能力的IC50分别为1293.6、62.0、49.2μg／mL。其中，对DPPH自由基清除能力、还原能力、对β-胡萝卜素的漂白能力以及对羟自由基损伤DNA的保护作用均与浓度在一定范围内呈量效关系。相关性分析显示丹酚酸中Sal B含量和还原能力的相关性最高，相关系数（r）为0.9644，其次为对DNA氧化损伤的保护作用，r为0.9012。3．丹酚酸对大鼠急性肝损伤模型的保护作用结果显示，与CCl4组相比，丹酚酸RE能明显降低大鼠血清AST、ALT的含量（p＜0.05），各丹酚酸RE组大鼠血清和肝组织的SOD活性活力上升，MDA含量降低，GSH含量升高（p＜0.05），能减轻肝组织的病理改变。4．本实验以丹酚酸为例，构建了植物化学物在线清除自由基活性指纹标识技术，该技术能够在不需分离制备情况下，实现快速检测、筛选抗氧化植物化学物先导成分。结果一次性获得13种丹酚酸清除DPPH自由基活性，随着丹酚酸浓度的增高，各丹酚酸对DPPH自由基的清除能力逐渐增大。其中出峰时间在55.8min的Sal B清除自由基的能力最高，其后依次为SA8＞SA6＞SA12＞SA5＞SA1。5．采用HPLC定量测定丹酚酸的血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）活性结果显示：建立的色谱条件下，可通过测定血管紧张素转换酶（ACE）水解马尿酰-组氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu）后产生的马尿酸的量获得丹酚酸的ACEI活性。香丹注射液（以丹酚酸为主成分）和丹酚酸EE对ACE有明显的抑制作用，香丹注射液浓度为原注射液的1／8时，抑制活性达到39.95％，丹酚酸EE浓度在1mg／mL时，抑制活性为31.44％，随着各自浓度的上升，其ACEI活性逐渐增加，有一定的量效关系。DSS、CA、原儿茶醛、Sal B在浓度为1mg／mL时，ACEI活性分别为94.70％、62.26％、49.39％、23.14％。结论：建立的HPLC条件，能对丹酚酸的不同组分进行标识和表征。在采用的反应体系中，丹酚酸表现出不同程度的抗氧化能力，对DNA损伤具有保护作用。Sal B可能是丹酚酸中的主要抗氧化物质。丹酚酸抗氧化途径主要是通过酚羟基提供氢质子，破坏自由基链式反应过程。通过抑制DNA链的断裂并延迟其受损时间，从而消除羟自由基对DNA的攻击损伤。体内氧化损伤模型研究表明，丹酚酸可提高实验性大鼠机体抗氧化能力，减轻CCl4对机体造成的急性肝损伤，丹酚酸对氧化损伤的肝组织具有一定保护作用。通过HPLC-DPPH在线标识技术，能够实现对多组分丹酚酸抗氧化能力的同时综合研究。不同丹酚酸物质对DPPH自由基清除的活性各不相同，Sal B是丹酚酸中活性最高的物质。丹酚酸ACEI活性研究及特征标识结果提示，丹酚酸物质群及其构成单体均具有一定程度的ACEI活性，丹酚酸的抗氧化作用可能渗透到RAS系统，参与RAS调节。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一章 丹酚酸分离及表征
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二章 丹酚酸抗氧化能力及对DNA损伤的保护作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三章 丹酚酸对大鼠急性肝损伤模型的保护作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四章 丹酚酸在线清除自由基活性指纹标识
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第五章 丹酚酸ACEI活性研究及特征标识
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 综述1 丹酚酸对组织的保护作用及体内代谢的研究
• 综述2 植物化学物抗氧化活性在线标识技术研究