论文题目: （木奈）多酚氧化酶基因及5’端调控序列的克隆
论文类型: 博士论文
论文专业: 果树学
作者: 陈桂信
导师: 吕柳新,潘东明
关键词: 木奈,多酚氧化酶,基因克隆,端调控序列
文献来源: 福建农林大学
发表年度: 2005
论文摘要: (木奈)(Prunus salicina Lindl. var. cordata J.Y.Zhang et al)生产上普遍存在果肉的褐变现象,造成果实的食用品质和耐贮性下降,甚至丧失其商品价值。(木奈)果肉褐变是多酚类物质、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)与氧结合起酶促反应的结果。本研究采用RT-PCR、RACE和染色体步移等分子生物学技术,从(木奈)嫩芽和果肉中分离PPO基因及5′端调控序列,为进一步采用反义RNA技术,进行遗传转化,解决(木奈)果肉褐变问题开辟一条新的遗传改良途径。主要试验结果如下: 1.建立了(木奈)基因组DNA的提取和纯化方法。为解决(木奈)组织器官内多酚类物质、多糖、色素等物质的干扰,本试验以(木奈)嫩芽为材料,加入10%(W/W)PVPP与材料充分研磨,提取缓冲液中β-巯基乙醇的浓度为1%(V/V);用氯仿/异戊醇(24:1)抽提裂解液2次,在所获得的上相中,加入1/10体积经65℃预热的NaCl/CTAB溶液,混匀,再用氯仿/异戊醇(24:1)连续抽提2次;在DNA粗提液中加入2/3体积的5M NaCl和3倍体积冰冷的无水乙醇沉淀DNA。结果表明,该方法能有效地去除(木奈)嫩芽中多酚和多糖等杂质,所得DNA样品比较纯净、完整,可以直接用于后续的PCR扩增、酶切和染色体步移。 2.建立了(木奈)嫩芽总RNA的提取和纯化方法。通过加入10%(W/W)PVPP与材料共研磨,并在TriZoL提取液中加入1%(V/V)β-巯基乙醇;在匀浆液中加入终浓度为20%乙醇沉淀多糖;在裂解液抽提的上相中加入终浓度为3MLiCl沉淀RNA;在RNA的粗提液中加入1/30体积的3M NaAc(pH5.2)和0.1倍体积的无水乙醇沉淀多糖。试验结果表明,该方法有效地去除了(木奈)嫩芽中多酚、多糖等杂质,获得纯净、完整的RNA样品,直接用于后续的RT-PCR和RACE反应。 3.建立了(木奈)果肉总RNA提取和纯化方法。提取缓冲液中的Tris-HCl和EDTA的pH值为8.8,CTAB的浓度为2.5%(W/V),并加入0.5%SDS(W/V),中和果肉中的有机酸;在裂解后的果肉样品中加入终浓度为15%(VN)无水乙醇,用氯仿抽提2次;在RNA的粗提液中加入1/30体积3M NaAc(pH5.2)和0.1倍体积无水乙醇沉淀多糖2次。试验结果表明,该
论文目录:
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缩写词
前言
一 文献综述
1 植物PPO基因的克隆
2 植物PPO基因的结构与特性
2.1 多基因家族性
2.2 序列的保守性
2.3 植物绝大多数PPO基因没有内含子
2.4 植物PPO基因的表达大多经过翻译后的加工过程
2.5 时空表达的特异性
3.遗传转化
二 研究背景
三 研究内容与技术路线
1 研究内容
2 技术路线
第一章 试验材料与方法
1 试验材料
1.1 植物材料
1.2 菌株和质粒
1.3 试剂
1.4 试剂盒
1.5 引物合成与测序
2 试验方法
2.1 RT-PCR
2.2 3′RACE
2.3 染色体步移
2.4 PCR产物的直接纯化
2.5 目的片段的回收
2.6 目的片段与载体的连接
2.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备—CaCl_2法
2.8 连接产物的转化
2.9 质粒的提取与纯化
2.10 重组质粒的PCR检测
第二章 (木奈) 基因组DNA提取与纯化方法的建立
1 试验材料
1.1 植物材料
1.2 试剂、酶与引物
2 试验方法
2.1 (木奈) 基因组DNA提取与纯化方法的建立
2.2 (木奈) 基因组DNA含量和纯度的测定
2.3 电泳分析
2.4 (木奈) 嫩芽PPO基因保守区的PCR扩增
3 结果与分析
第三章 (木奈) 嫩芽和果肉总RNA提取与纯化方法的建立
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 (木奈) 嫩芽总RNA提取与纯化方法的建立
1.3 (木奈) 果肉总RNA提取与纯化方法的建立
1.4 电泳分析
1.5 总RNA纯度和含量的测定
2 结果与分析
2.1 不同提取方法对(木奈) 嫩芽总RNA产量和质量的影响
2.2 不同提取方法对(木奈) 肉总RNA产量和质量的影响
第四章 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶基因及5′端调控序列的克隆
1.试验材料
1.1 植物材料
1.2 试剂盒
2 试验方法
2.1 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶保守区cDNA的克隆
2.2 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶cDNA的3′RACE
2.3 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶基因5′端的克隆
2.4 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶基因5′端调控序列的克隆
3 结果与分析
3.1 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶保守区cDNA的克隆与序列分析
3.2 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶cDNA的3′RACE
3.3 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶基因5′端的克隆与序列分析
3.4 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶基因编码区序列的获得与序列分析53
3.5 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶基因编码的蛋白结构分析
3.6 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶基因5′端调控序列的获得与序列分析
第五章 (木奈) 果肉多酚氧化酶基因的克隆
1 试验材料
1.1 材料
1.2 试剂盒
2 试验方法
2.1 (木奈)果肉多酚氧化酶保守区cDNA的克隆
2.2 (木奈)果肉多酚氧化酶cDNA的3′RACE
2.3 (木奈) 果肉多酚氧化酶基因5′端的克隆
3 结果与分析
3.1 (木奈) 嫩芽多酚氧化酶保守区cDNA的PCR扩增与序列分析
3.2 (木奈) 果肉多酚氧化酶cDNA的3′RACE与序列分析
3.3 (木奈) 果肉多酚氧化酶基因5′端的克隆与序列分析
3.4 (木奈) 果肉多酚氧化酶基因编码区序列的获得与序列分析
3.5 (木奈) 果肉多酚氧化酶基因编码的蛋白结构分析
第六章 讨论
1 (木奈)基因组DNA提取与纯化过程中多酚、多糖等干扰物质的排除
2 (木奈)嫩芽和果肉总RNA提取与纯化过程中多酚、多糖等干扰物质的排除
3 (木奈)PPO多基因家族与序列的保守性
4 植物PPO基因是否存在内含子
5 (木奈)嫩芽PPO基因5′端调控的顺式作用元件分析
参考文献
附录1
附录2
附录3
附录4
附录5
附录6
附录7
附录8
附录9
附录10
附录11
附录12
附录13
致谢
博士在学期间发表论文情况
发布时间: 2005-09-27
参考文献
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