论文摘要
本研究根据超抗原和细胞因子的各自特性,构建成新型融合蛋白质即细胞生长因子-超抗原融合蛋白质,并研究了其在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达以及真核表达。（1）根据Genebank报道的VEGF （NM-003376）、SEA（A28664）基因序列,对密码子进行优化,由TaKaRa公司合成含BamHⅠ、Hind酶切位点的VEGF-pMD18-T simple和含XhoⅠ、HindⅢ酶切位点的SEA-pMD18-T simple质粒,SEA前面加Linker。（2）选用pET40b作为表达载体,将SEA和VEGF基因片段依次连接至质粒pET40b中,构建重组质粒pET40b-VEGF-SEA。重组质粒经菌落PCR、双酶切鉴定以及序列分析,证明重组表达质粒pET40b-VEGF-SEA构建成功。（3）从pET40b-VEGF-SEAⅢ上切下VEGF-SEA片段,将序列确认正确的VEGF-SEA基因片段克隆至表达载体pET22b,经过菌落PCR、双酶切鉴定以及序列分析,表明重组质粒pET22b-VEGF-SEA构建成功。（4）将两种表达载体均转化大肠杆菌BL21（DE3）进行IPTG诱导表达,通过调整参数,对影响诱导效果的诱导物浓度和诱导时间进行探索,确定最佳诱导条件为：IPTG终浓度1 mmol/L,于25℃培养4h。（5）表达产物经SDS-PAGE分析蛋白条带与预期一致,证明融合蛋白原核表达成功。融合蛋白在宿主菌中以包涵体的形式表达,表达量约占总蛋白量的30%。（6）对包涵体进行洗涤、变性与透析复性,复性回收率达60%。将透析后得到的溶液用His·Bind buffer kit试剂盒进行纯化。蛋白产物经纯化,纯度达到90%。（7）构建重组质粒pEGFP-Nl-VEGF-SEA,用脂质体转染法转入乳腺癌细胞MCF-7。获得了目的基因的真核表达,并能观察到荧光。用G418筛选出稳定转染细胞并分离出单克隆细胞株。
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摘要ABSTRACT1 前言1.1 研究背景1.2 超抗原1.2.1 超抗原的种类1.2.2 金黄色葡萄菌肠毒素A1.2.3 超抗原与T细胞结合的特征1.2.4 超抗原的抗肿瘤机制1.2.5 SEA抗肿瘤研究进展1.2.6 存在的问题与前景1.3 血管内皮细胞生长因子VEGF1.3.1 简介1.3.2 抗肿瘤功能1.4 本论文的立题依据1.5 研究内容2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 菌株与质粒2.1.2 主要试剂2.1.3 培养基2.1.4 相关溶液2.1.5 抗生素2.1.6 主要仪器2.2 方法2.2.1 血管内表皮生长因子和超抗原融合基因的克隆2.2.2 克隆载体pET40b-VEGF-SEA的构建2.2.3 表达载体pET22b-VEGF-SEA的构建2.2.4 转化子的鉴定2.2.5 目的蛋白的原核表达及大规模培养2.2.6 目的基因的真核表达3 结果与讨论3.1 选用菌株3.1.1 宿主菌株3.1.2 大肠杆菌JM1093.1.3 大肠杆菌BL21（DE3）3.2 载体3.2.1 pET载体3.2.2 本试验所用载体3.3 合成目的基因序列3.4 重组质粒pET40b-VEGF-SEA的构建及转化3.4.1 重组质粒的构建3.4.2 重组子转化大肠杆菌JM1093.4.3 重组子的鉴定3.4.4 小结3.5 表达载体pET22b-VEGF-SEA的构建3.5.1 载体pET22b的特性3.5.2 表达载体的构建3.5.3 转化大肠杆菌JM1093.5.4 重组子的筛选和鉴定3.5.5 小结3.6 融合蛋白VEGF-SEA的氨基酸序列3.7 最佳诱导条件优化3.7.1 IPTG诱导量分析3.7.2 诱导时段的选择3.7.3 诱导温度实验3.7.4 诱导时间的确定3.7.5 小结3.8 VEGF-SEA在大肠杆菌BL21中的诱导表达3.8.1 目的蛋白的表达3.8.2 目的蛋白的分析3.9 包涵体的溶解和复性3.9.1 包涵体的产生3.9.2 包涵体的洗涤及复性3.9.3 目的蛋白的纯化3.9.4 小结3.10 细胞培养级转染3.10.1 细胞复苏培养3.10.2 筛选稳定转染细胞株3.10.3 稳定转染子单克隆细胞株的筛选3.10.4 细胞生长曲线3.10.5 小结4 结论5 展望6 参考文献7 论文发表情况8 致谢
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