鼠疫耶尔森氏菌毒力相关蛋白蛋白芯片的研制与血清抗体谱的研究

论文摘要

背景 鼠疫是一种烈性传染病,到目前为止人们对鼠疫的致病因素、流行机制还没有完全了解。虽然现在已经有多种鼠疫疫苗,但这些疫苗对肺型鼠疫的免疫保护作用并不理想。基于F1和V抗原基础上,加入其它具有免疫保护作用成分的多亚单位疫苗将是未来鼠疫疫苗研究的一个方向。对感染患者与免疫动物体内血清抗体谱的研究将为更好的了解鼠疫的致病机制,寻找新的亚单位疫苗成分提供线索。蛋白芯片技术是近年来发展起来的能够同时研究多个抗原-抗体、蛋白-蛋白相互作用的高通量技术,它具有大规模、高通量、所需样品少等特点。 方法 挑选出202条鼠疫菌已知的或推测的与毒力相关蛋白的基因与表达载体pET32a连接在大肠肝菌BL21（DE3）中表达,利用表达的目的蛋白氨基端带有6×His标签与Ni-NTA具有亲和的原理,通过96孔板对蛋白进行高通量纯化。纯化的蛋白点在醛基化玻片上制备蛋白芯片。通过与鼠疫患者血清、EV76疫苗株免疫兔血清、鼠疫菌感染兔血清及自然疫源地黄鼠血清反应,检测不同血清中抗体升高的种类及趋势。 结果 通过与不同来源的鼠疫菌感染血清作用,共有15个蛋白在所有的血清中均检测到相应抗体,其中YPMT1.84,YPMT1.24c,YPMT1.48c,YPCD1.31c,YPCD1.28,YPCD1.32c,YPCD1.26c,YPCD1.06c,YPO1435,YPO1303,YPO2118,YPO3319,YPO2113,YPO2090,YPO2394抗体升高幅度大,持续时间长,这些蛋白可以作为下一阶段鼠疫疫苗研究的重点,研究其保护性。除了在所有的血清抗体谱中均升高的蛋白外,在各不同血清的抗体谱中均存在特异性抗体升高的蛋白,这些蛋白可能与鼠疫菌在机体内的致病性相关。分析不同感染状态下的抗体谱,将为更深入的了解鼠疫菌的致病机制提供线索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 鼠疫流行概况
• 2 鼠疫的诊断
• 3 鼠疫疫苗研究的进展
• 4 鼠疫基因组学研究
• 5 蛋白芯片的研制与应用
• 6 本实验的目的与意义
• 7 本研究的技术路线
• 一 鼠疫菌毒力相关基因的克隆与表达
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 二 表达蛋白的高通量纯化与蛋白芯片的构建
• 引言
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 三 血清抗体谱的研究
• （一） EV76疫苗株免疫兔血清的抗体谱
• 1.材料与方法
• 2.结果
• （二） 鼠疫菌感染兔血清抗体谱
• 1 村料与方法
• 2 结果
• （三） 鼠疫患者血清抗体谱的变化
• 1.材料与方法
• 2 结果
• （四） 新疆黄鼠血清抗体谱
• 1 材料与方法
• 2.结果
• （五） 讨论
• 一 蛋白芯片技术平台的可靠性
• 二 蛋白未检测到相应抗体的原因分析
• 三 不同血清中抗体谱的区别
• 三 不同血清抗体谱不同的原因分析
• 四 血清抗体谱的分析
• 总结
• 参考文献
• 附表
• 附表1 表达的202个基因的基因注释与扩增片断的长度
• 附表2 扩增202个基因的引物及酶切位点
• 综述
• 在读期间发表的论文
• 致谢