AFM研究高尔基体和内质网的结构

论文摘要

高尔基体和内质网作为内膜系统的主要成员，它们位于细胞经典的分泌途径。它们具有不同的结构和功能，同时它们的功能具有一定的联系性，这种联系主要表现在蛋白质的合成、加工分泌方面以及生物膜的形成运输方面。高尔基体和内质网的结构和功能的分子机制研究是目前和今后相当长时间内细胞生物学领域的研究前沿。目前，对高尔基体和内质网结构和功能的研究主要是通过电镜以及一些在电镜基础上发展起来的其他技术，包括3-D EM, EM tomography等间接的方法。由于研究方法的局限性，因此在分子水平对高尔基体和内质网复杂的结构的理解仍然不是很明确。在本实验中，我们利用高分辨原位原子力显微镜（AFM）直接对这两个细胞器进行了高分辨的观察研究，并获取了以下研究结果：（1）利用原子力显微镜（AFM）对高尔基体的堆叠，囊膜，以及相关的微管和囊泡的等结构进行了直接的成像。同时，我们获得了新的发现：我们利用高分辨原位原子力显微镜成像了高尔基体囊膜的内外膜结构，确定了脂筏结构存在于高尔基体膜上。AFM结果还表明高尔基体外膜是光滑的，其平均粗糙度为0.82±0.24nm，而内膜因有密集的蛋白分布而相对较粗糙，其平均粗糙度为1.95±0.62nm。我们利用实时AFM研究了MβCD和TX-100对内膜的影响，揭示了大多数脂筏是呈不规则形状，且大小分布在20-200nm之间。（2）利用原子力显微镜（AFM）直接成像了粗面内质网和光面内质网的囊泡状结构。粗面内质网和光面内质网的单个囊泡结构的放大成像显示：光面内质网囊膜是膨胀而卷曲的，其表面是光滑的；相反，光面内质网囊膜是呈扁平状的，有一些颗粒状物质分布在其表面，这些结构的大小在10-20nm之间，与核糖体的尺寸很一致。综上所述，本文利用原位AFM在近生理条件下对高尔基体和内质网的生物物理特性在纳米尺度进行较深入详细的研究，获得了大量有价值的实验结果。对这两个细胞器在分子水平的研究对我们进一步揭示它们结构与功能之间的关系具有重要意义并且可能为研究活细胞生物膜系统的循环奠定了一定的基础。同时，这也有利于我们进一步研究高尔基体和内质网在功能上的相关性，为我们进一步探讨与高尔基体和内质网相关疾病的治疗方法奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 一 原子力显微镜的概述
• （一） 原子力显微镜介绍
• （二） 原子力显微镜在细胞生物学研究中的应用
• （三） 细胞固定方法的讨论
• （四） AFM 在细胞生物学研究中的优势以及不足
• （五） 展望
• 二 高尔基体的概述
• 三 内质网的概述
• 四 研究内容与意义
• 材料与方法
• 一 实验材料
• （一） 细胞株与试剂
• （二） 实验仪器
• 二 实验方法
• （一） HeLa 细胞培养以及细胞匀浆的制备
• （二） HeLa 细胞高尔基体的分离提取流程
• （三） HeLa 细胞内质网的分离提取流程
• （四） APTES 修饰云母
• （五） 戊二醛功能化的 AP 修饰云母的制备和高尔基体样品的吸附
• （六） 原子力显微镜成像以及数据分析
• （七） 荧光图像
• 结果与讨论
• 一 基于 AFM 的高尔基体生物物理特性的研究
• （一） 利用荧光显微镜和原子力显微镜对高尔基复合体结构的研究
• （二） 单个高尔基体囊膜的 AFM 表征
• （三） 在近生理条件下观察高尔基体的内膜结构
• （四） AFM 原位实时成像 MβCD 处理的高尔基体膜片
• （五） AFM 原位实时成像高尔基体膜片的 DRMs
• 二 基于 AFM 的粗面内质网和光面内质网生物物理特性的研究
• （一） 粗面内质网囊膜的 AFM 表征
• （三） 光面内质网膜片的 AFM 表征
• 结论
• 参考文献
• 致谢