菊花C2H2型锌指蛋白基因CgZFP1的克隆与功能鉴定

论文摘要

菊花原产我国,是我国十大传统名花和世界四大切花之一,观赏和经济价值极高,在花卉生产中占有重要地位。非生物逆境如设施栽培中的土壤盐渍化、水资源匮乏引物的干旱胁迫等已逐渐成为菊花周年供应的主要限制因素。因此,抗逆菊花的培育尤为迫切。传统育种存在育种周期长、性状改良具不定向等不足,近年,转基因生物技术育种因具有定向改良某一目标性状的优点而被用于诸多植物抗性育种,而优异抗性基因的储备则是抗性基因工程育种的前提。本研究克隆了菊花C2H2型锌指蛋白基因CgZFP1,并进行了序列特征、转录激活活性分析,并通过转化拟南芥初步进行了功能验证,为菊花基因工程育种提供优异基因储备。主要结果如下：本研究通过设计简并引物,利用RT-PCR和RACE等技术克隆了菊花‘钟山紫桂’C2H2型锌指蛋白基因的全长cDNA,命名为CgZFP1。序列分析显示,CgZFP1全长966bp,开放阅读框（ORF）为744bp,编码248个氨基酸,其编码产物含有两个典型的C2H2锌指结构。序列比对发现,CgZFP1与矮牵牛ZFP2-3、苜蓿Mt-ZFP1和辣椒CaZFP1等的同源性分别为55.86%、53.57%和54.44%。系统进化树分析表明,CgZFP1与矮牵牛ZFP2-3、番茄SLZF1的C2H2锌指蛋白的亲缘关系较近。荧光定量PCR （qRT-PCR）显示,在干旱,高盐和低温胁迫下3h后,‘钟山紫桂’叶片中CgZFP1的表达水平便迅速提高。200mM NaCl胁迫下,叶片中DgZFP1基因的表达水平在胁迫后逐步增加,在处理12h后表达量达至顶峰,随后表达量有所下降。模拟干旱（20%PEG6000）处理3h后基因的表达量就达到峰值,随后开始缓慢下降。CgZFP1基因的表达水平也受低温（4℃）的诱导,在低温处理6h后基因的表达量达到最大值,随后又小幅回落并维持在一个相对稳定的水平。ABA处理后叶片中CgZFPl基因的表达水平和对照均无明显的变化。本研究构建了酵母转化载体并成功转化酵母细胞YH109,该酵母基因组中含有报告基因His3,其上游具有激活序列UAS,能调节His3的表达。将阳性酵母菌划线培养在SD/-His-Ade上,pGBKT7-CgZFPl重组子和阳性对照正常生长,而阴性对照pGBKT7不能存活,这表明CgZFP1在酵母中具有转录激活活性。构建了CgZFP1基因植物表达载体,采用农杆菌介导的花序侵染法将CgZFP1基因转化拟南芥,对其中的2个转基因株系35S::CgZFP1-2和35S::CgZFPl-12进行耐逆性研究。发现转基因拟南芥的抗盐性和抗旱型较野生型明显增强。荧光定量PCR检测发现CgZFP1在转基因拟南芥植株大量表达。同时,CgZFP1转基因植株在干旱胁迫下Atlea3、AtP5CS2、AtProT1、AtMnSOD、AtPOD、AtAPX1、AtPIP2A基因的表达量较对照植株有显著提高。在高盐胁迫下,AtMYB21、Atlea3、AtP5CS2、AtProT1、 AtMnSOD、AtPOD、AtAPXl、AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3、AtNHX1与胁迫相关基因在转CgZFP1基因拟南芥植株的表达水平明显较野生型和转空载体拟南芥植株中增强。表明在干旱和高盐胁迫下,CgZFP1均可调控渗透调节、抗氧化程度；而高盐胁迫下,该基因还可启动离子转运,水分胁迫下则可调节水分运输基因。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略词表
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 植物逆境胁迫响应分子机制研究
• 1.1 植物响应非生物胁迫表达的基因
• 1.1.1 逆境胁迫下直接发挥功能的功能蛋白
• 1.1.2 渗透调节物质合成酶
• 1.1.2.1 离子调节相关的基因
• 1.1.2.2 脯氨酸代谢相关的基因
• 1.1.2.3 甜菜碱代谢相关的基因
• 1.1.2.4 糖类物质代谢相关的基因
• 1.1.2.5 多醇类物质代谢相关的基因
• 1.1.3 活性氧代谢相关基因
• 1.1.3.1 超氧化物歧化酶（SOD）基因
• 1.1.3.2 过氧化物酶（POD）基因
• 1.1.3.3 过氧化氢酶（CAT）基因
• 1.1.3.4 抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因
• 1.2 植物在逆境胁迫下产生的调节基因
• 1.2.1 蛋白激酶基因
• 1.2.2 参与信号传导第二信使生成的蛋白酶
• 2 参与非生物胁迫应答的植物转录因子
• 2.1 植物转录因子的结构
• 2.2 与植物非生物胁迫相关的转录因子
• 3 植物C2H2型锌指蛋白的研究进展
• 3.1 植物C2H2型锌指蛋白的结构
• 3.2 植物C2H2型锌指蛋白的功能区
• 3.3 植物C2H2型锌指蛋白与目标DNA的识别
• 3.4 植物逆境胁迫相关的C2H2型锌指蛋白
• 4 本研究的目的意义
• 第二章 菊花CGZFP1基因的克隆与序列分析
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA提取质量与反转录效果检测
• 2.2 CgZFP1基因的克隆
• 2.3 CgZFP1基因的序列特征
• 3 讨论
• 第三章 菊花CGZFP1基因的表达特性及功能研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同处理下CgZFP1基因在菊花叶片的表达情况
• 2.2 CgZFP1转录激活活性分析
• 2.3 CgZFP1基因植物双元表达载体的构建
• 2.4 拟南芥CgZFP1转基因植株的PCR鉴定及筛选
• 2.5 转基因植株在不同处理下CgZFP1基因的表达
• 2.6 转基因植株的抗性鉴定
• 3 讨论
• 全文结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢