锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性质及活力调控的研究

论文摘要

以锯缘青蟹（Scylla serrata）内脏为材料,通过含0.2 mol/L NaCl的0.01 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱过滤层析、DE-32离子交换柱层析,获得了比活力为7,990 U/mg的电泳单一纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂（NAGase, EC 3.2.1.52）。该酶的等电点为4.68,分子量约为132 kD,每个酶蛋白分子含有约1097个氨基酸残基,其中非极性占39.1%,碱性占7.1%,酸性占24.0%,极性不带电荷的占29.8%。该酶含两个分子量约为65.8 kD的同型亚基,肽链间不含二硫键而肽链内含有二硫键。该酶为糖蛋白,其中含糖量为12.85 %（w/w）。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（pNP-NAG）为底物,测得该酶在0.05 mol/L NaAc-HAc缓冲液（ pH 5.8 ）中催化水解pNP-NAG的最适pH为5.6,最适温度为50℃;该酶在45℃以下,pH 4.6-8.6范围内稳定。pH 5.8下,酶水解pNP-NAG的米氏常数Km为0.424±0.012 mmol/L,最大反应速度Vmax为17.65±0.32μmol?L-1?min-1,反应的活化能为61.32 KJ/mol。半胱氨酸的疏基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基、酸性氨基酸的β-羧基和赖氨酸的ε-氨基是酶的活性功能基团。精氨酸残基、丝氨酸残基不是酶的活性所必需。同时,酶分子链内二硫键的形成不是该酶活性所必需。30℃下酶活性中心解离常数pKe为5.40,解离热焓?Ho为7.812 kcal/mol,表明与酶活性有关的可解离基团是组氨酸的咪唑基;产物NAG与产物pNP的类似物苯酚、对羟基苯甲酸对酶的抑制作用表明,酶催化底物pNP-NAG水解反应属有序双双机理。在变性剂盐酸胍的作用下,酶分子的活力变化快于构象的变化,说明酶分子的活性中心处于对胍较敏感的区域。养殖水体中富营养化产生的氨态氮,SO3-对酶有较强的抑制作用。水体主要有机污染物苯酚对酶有明显的抑制作用,与苯酚相比,邻苯二酚对酶的抑制作用减弱,对苯二酚对酶的抑制作用加强,对羟基苯甲酸的抑制作用最强,这种差异与苯环上基团的性质密切有关。Cu2+与底物竞争和酶结合产生抑制,Zn2+对酶的抑制为混合型,Zn2+使酶活力的变化快于构象的变化,而Cu2+使酶构象的变化快于活力的变化。养殖水体常用消毒药物中,次氯酸钠、二氯异氰尿酸钠、三氯异氰尿酸、季氨盐、聚维酮碘、过氧化氢对酶的活力有不同程度的影响。同时,次氯酸钠、二

论文目录

• 摘要
• Abstracts
• 第一章 引言
• 1.1 锯缘青蟹简介
• 1.1.1 形态特征与生活习性
• 1.1.2 锯缘青蟹的养殖现状与存在问题
• 1.1.3 锯缘青蟹的研究概况
• 1.2 几丁质酶系研究概况
• 1.2.1 几丁质与几丁质酶系简介
• 1.2.2 几丁质酶系的研究概况
• 1.2.3 甲壳动物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的研究情况
• 1.3 本课题的研究内容与研究意义
• 第二章 实验材料、仪器与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 蛋白质浓度的测定
• 2.3.2 酶活力测定和比活力的计算
• 2.3.3 酶的分离纯化
• 2.3.4 酶的纯度鉴定
• 2.3.5 酶的理化性质的测定
• 2.3.6 酶催化pNP-NAG水解反应的动力学性质研究
• 2.3.7 酶活性中心解离基团性质的研究
• 2.3.8 酶的化学修饰
• 2.3.9 产物与产物类似物对酶的影响
• 2.3.10 变性剂盐酸胍对酶活力与构象的影响
• 2.3.11 金属离子对酶的影响
• 2.3.12 水体氨态氮、亚硝酸盐氮与亚硫酸盐对酶的影响
• 2.3.13 有机物溶剂二甲亚砜与苯酚类物质对酶的影响
• 2.3.14 青蟹养殖常用药物对酶的影响
• 第三章 实验结果
• 3.1 锯缘青蟹NAGase的分离纯化与纯度鉴定
• 3.2 锯缘青蟹NAGase的理化特征
• 3.2.1 酶的分子量
• 3.2.2 酶的等电点
• 3.2.3 酶的亚基数及亚基的分子量
• 3.2.4 酶分子内二硫键的判断结果
• 3.2.5 酶分子中糖含量的测定结果
• 3.2.6 酶的氨基酸组成
• 3.2.7 酶的紫外特征吸收光谱与内源荧光特征光谱
• 3.3 酶催化pNP-NAG 水解反应的动力学性质
• 3.3.1 酶催化pNP-NAG 水解反应的最适pH 及pH 稳定性
• 3.3.2 酶催化pNP-NAG 水解反应的最适温度及酶的热稳定性
• 3.3.3 酶催化pNP-NAG 水解的动力学参数
• 3.3.4 酶催化pNP-NAG 水解反应的活化能
• 3.4 酶活性中心解离基团的性质
• 3.4.1 pH 对酶催化pNP-NAG 水解反应的效应
• 3.4.2 酶活性中心解离基团的解离常数
• 3.4.3 温度对酶活性中心可解离基团解离常数的影响
• 3.4.4 酶活性中心功能基团的解离热焓
• 3.5 酶的化学修饰
• 3.5.1 DTT 对酶的化学修饰
• 3.5.2 pCMB 对酶的化学修饰
• 3.5.3 组氨酸咪唑基的化学修饰
• 3.5.4 色氨酸残基的化学修饰
• 3.5.5 羧基的化学修饰
• 3.5.6 氨基的化学修饰
• 3.5.7 精氨酸残基的化学修饰
• 3.5.8 丝氨酸残基的化学修饰
• 3.6 产物及产物类似物对酶的影响
• 3.6.1 产物与产物类似物对酶的抑制效应
• 3.6.2 产物与产物类似物对酶的抑制为可逆过程
• 3.6.3 产物与产物类似物对酶的抑制类型
• 3.7 酶经盐酸胍变性后活力与构象变化结果
• 3.7.1 酶经盐酸胍变性后活力变化结果
• 3.7.2 低浓度盐酸胍对酶的作用表现为可逆过程
• 3.7.3 酶经盐酸胍变性后荧光发射光谱变化结果
• 3.7.4 酶经盐酸胍变性后活力变化与构象变化结果比较
• 3.8 酶在盐酸胍溶液中的失活作用动力学
• 3.8.1 酶在盐酸胍溶液中失活动力学模型的建立
• 3.8.2 酶在盐酸胍溶液中的失活速度常数的求解方法
• 3.8.3 酶在盐酸胍溶液中的失活微观速度常数测定结果
• 3.9 金属离子对酶的效应
• ²⁺对酶的影响与抑制动力学'>3.9.1 Cu²⁺对酶的影响与抑制动力学
• 2+对酶的影响与抑制动力学'>3.9.2 Z11²⁺对酶的影响与抑制动力学
• 3.10 水体氨态氮与亚硝酸盐氮对酶的影响
• 3^2-对酶的影响'>3.11 水体SO₃^2-对酶的影响
• 3.12 有机物溶剂二甲亚砜对酶的影响
• 3.13 苯酚对酶抑制作用的动力学
• 3.14 青蟹养殖常用药物对酶的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 酶的分离纯化与理化性质
• 4.2 酶活性中心的功能基团
• 4.3 酶在盐酸胍变性作用下的失活与去折叠研究
• 4.4 产物对酶的抑制与酶的催化机理
• 4.5 金属离子对酶的影响
• 4.6 养殖水体富营养化污染物对酶的影响
• 4.7 苯酚对酶的影响
• 4.8 青蟹养殖常用药物对酶的影响
• 结论
• 参考文献
• 博士研究生期间发表的学术论文
• 已发表论文:
• 已接受待发表论文:
• 致谢