论文摘要
转基因动物是目前生物领域的研究热点之一，其通过改变了动物的遗传组成，使动物按照人们的意愿进行改造。以传统的原核显微注射法生产转基因动物的效率非常低下（成功率仅为3～5％），严重地制约了转基因动物研究进展。与之相比，体细胞克隆技术在生产转基因动物方面有着不可比拟的优越性，成为目前生产转基因家畜的最佳方法。绿色荧光蛋白（GFP）转基因猪研究可以为家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础。本实验研究了质粒浓度，脂质体浓度，脂质体-质粒复合物与细胞共孵育时间对GFP转染猪胎儿成纤维细胞效率的影响，通过G418的筛选，获得稳定表达绿色荧光蛋白基因的阳性细胞，并以此阳性细胞作为体细胞核移植的核供体，以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎，并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。取得如下结果：1．G418筛选浓度为500μg／ml，维持筛选浓度为2001μg／ml，在筛选到30天左右时，可以获得较纯的、能稳定表达绿色荧光蛋白的猪胎儿成纤维细胞；2．原代至3代的PFF，24孔培养板70～90％汇合程度，采用脂质体转染试剂（lipofecttransfection regent）为2.0μl、质粒（pEGFP-C1）0.8μg，复合物作用时间为6h时获得的转染效率最高，转染效率约3.78％；3．GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为11.4％，GFP阳性胚胎率为55.2％；4．重构胚移植于10头受体后，有5头妊娠，3头受体发育到期，共产出克隆猪6头，其中4头为GFP阳性，经DNA检测确认为GFP转基因猪；转基因克隆胚胎移植出生率为1.0％，阳性个体出生率为0.7％。结果表明脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞，获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。通过体细胞核移植技术生产转基因克隆猪，建立了一套较完善的体细胞传代培养、体细胞转染、阳性细胞筛选和传代、转基因克隆胚胎的生产和移植的生产体系，为今后在猪基因组上进行更深层次的研究打下基础。这是我国的第一批转基因克隆猪，对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要的参考价值。