C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究

论文摘要

近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组表达技术研制预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸（DNA）疫苗倍受青睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于DNA疫苗蛋白表达量低,激发的免疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高DNA疫苗的免疫效果已成为基因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸腺肽和补体分子佐剂等是提高DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中补体C3d分子佐剂倍受人们的关注。补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d已经成为核酸疫苗有效的新型分子佐剂。但是C3d作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强作用的差异性需要作进一步的研究。PRRSV GP5基因编码的GP5蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH基因是沙门氏菌A-E群的高度保守基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。本研究首先对哺乳动物猪、鼠的C3d基因进行克隆及序列测定分析,并探讨了不同种动物（猪、鼠、鸡、鸭）间补体C3d在基因水平上的相关性和差异性,然后以PRRSV GP5为模型基因,利用鼠、猪（哺乳动物）C3d的受体结合功能区p28和鸡、鸭（禽类动物）C3d的受体结合功能区p29作为分子佐剂,构建了C3d-p28（29）.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗和沙门氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检测,探讨不同动物C3d-p28（29）对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分内容:1、哺乳动物猪、鼠补体C3d基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物（猪、鼠）的补体C3d基因克隆并比较同禽类动物（鸡、鸭）C3d基因序列的差异性,首先从哺乳动物鼠、猪的肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定并进行序列测定,然后进行C3d序列和CR2结合区同源性比较分析。电泳结果显示,分别在936bp和888bp处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的C3d基因克隆。序列分析结果表明,哺乳动物（猪、鼠）和禽类（鸡、鸭）的补体C3d基因同源性仅为64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d基因进化关系也越近。哺乳动物（猪、鼠）与禽类（鸡、鸭）C3d基因的CR2结合区比较分析发现,禽类为29个氨基酸,而哺乳动物为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为62%,而鼠、猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达82.8%和84%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的差异性。2、不同动物C3d分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗的构建:为探明不同动物C3d分子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物C3d cDNA的基础上,设计引物克隆C3d-p28（29）至pUC19载体,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ构建多聚体C3d-p28（29）.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）上;然后以RT-PCR扩增的PRRSV GP5基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-C3d-p28（29）.n中p28（29）.n上游,构建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 （29）.n重组质粒。酶切结果显示,电泳后在807、987、1167bp处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体C3d-p28（29）多聚体分子佐剂的PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.n）。3、不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗免疫增强效果研究:为了探索不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增强作用及差异性,在构建了鼠、猪、鸡、鸭四种动物补体C3d-p28（29）.n PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.2.4.6）及pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基础上,分别提取质粒,通过脂质体转染至Marc145细胞进行瞬时表达,并免疫BALB/c小鼠,然后利用不同ELISA试剂盒分别检测各免疫组小鼠的GP5抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。结果表明,以补体C3d-p28（29）.n为分子佐剂的PRRSV GP5基因重组疫苗均可在Marc145细胞内进行表达;连接不同动物C3d-p28（29）2,4,6聚体的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量均比空载体（pcDNA3.1）和pcDNA3.1-GP5对照组的升高,差异均显著（P<0.05）,其中以pcDNA3.1-GP5-p28（29）.6组的效果最佳,但均不如PRRSV油乳剂灭活苗组的效果好。另外,含有C3d-p28（29）.n（n=2,4,6）相同聚体的疫苗免疫组小鼠血清中的GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量两两比较无差异性。4、鼠C3d分子佐剂沙门氏菌invH基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究:为了进一步探讨分子佐剂C3d在细菌核酸疫苗中的免疫增强作用,以沙门氏菌invH为核酸疫苗的模式基因,构建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6重组质粒,免疫BALB/c小鼠并检测了小鼠血清中invH抗体和IL-4、IFN-γ的含量,然后进行小鼠攻毒保护试验。结果表明,小鼠血清中invH抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量与pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH对照组比较,差异均显著（P<0.05）。通过攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6核酸疫苗对小鼠的免疫保护率高于pcDNA3.1-invH组,差异显著（P<0.05）,与空白组和pcDNA3.1组比较,差异均极显著（P<0.01）,但核酸疫苗的保护效果不及灭活疫苗。本研究结果探明了动物C3d分子佐剂对病毒及细菌核酸疫苗的免疫增强作用,为开发利用不同动物C3d分子佐剂研制其他病原的核酸疫苗提供了理论依据和技术支持。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 核酸疫苗的研究进展
• 1.1.1 核酸疫苗的构成
• 1.1.1.1 抗原编码基因
• 1.1.1.2 真核表达质粒载体
• 1.1.2 核酸疫苗的分类
• 1.1.3 核酸疫苗可能的作用机制
• 1.1.4 核酸疫苗的免疫
• 1.1.4.1 靶细胞的选择
• 1.1.4.2 接种前动物组织的预处理
• 1.1.4.3 核酸疫苗的接种方法和途径
• 1.1.4.4 核酸疫苗的接种剂量
• 1.1.4.5 核酸疫苗的免疫佐剂选择
• 1.1.4.5.1 细胞因子佐剂
• 1.1.4.5.2 协同刺激分子佐剂
• 1.1.4.5.3 补体佐剂
• 1.1.4.5.4 免疫刺激序列(
• 1.1.4.5.5 霍乱毒素（choleratoxin,CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素(
• 1.1.4.5.6 蛋白转换域(
• 1.1.4.5.7 模拟或增强 MHC 作用
• 1.1.5 核酸疫苗的应用
• 1.1.5.1 寄生虫核酸疫苗
• 1.1.5.2 细菌核酸疫苗
• 1.1.5.3 病毒核酸疫苗
• 1.1.6 核酸疫苗研究的意义及展望
• 1.2 分子佐剂补体C3d 的研究进展
• 1.2.1 补体系统的组成
• 1.2.1.1 补体固有成分
• 1.2.1.2 补体调节蛋白
• 1.2.1.3 补体受体
• 1.2.2 补体的激活
• 1.2.2.1 经典激活途径
• 1.2.2.2 旁路途径
• 1.2.2.3 凝集素途径
• 1.2.3 C3d 的结构特征及生物学功能
• 1.2.3.1 C3d 的产生
• 1.2.3.2 C3d 的分子结构
• 1.2.3.3 C3d 的天然受体CR2
• 1.2.3.4 CR2 与C3d 的结合位点
• 1.2.4 C3d 佐剂作用的研究方法
• 1.2.4.1 C3d 分子间的直接串联
• 1.2.4.2 C3d 与CR2 结合功能区的串联
• 1.2.5 C3d 分子的佐剂作用
• 1.2.5.1 C3d 对体液免疫应答的影响
• 1.2.5.2 C3d 对细胞免疫应答的影响
• 1.2.5.3 C3d 对细胞因子表达类型的影响
• 1.2.5.4 对抗原特异性体液和细胞免疫的负向调节作用
• 1.2.5.5 小鼠品系对C3d 免疫作用的影响
• 1.2.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制
• 1.2.6.1 C3d 偶联抗原可增强CR2细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取
• 1.2.6.2 促进B 细胞活化，降低B 细胞的活化阈
• 1.2.6.3 促进抗体亲合力成熟
• 1.2.6.4 上调Raji 细胞协同刺激分子87-1 和87-2 的表达
• 1.2.6.5 依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用
• 1.2.7 不同动物C3d 的研究
• 1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 蛋白研究进展
• 1.3.1 PRRSV 的结构及其生物学特性
• 1.3.1.1 PRRSV 的形态结构
• 1.3.1.2 PRRSV 的理化性质
• 1.3.1.3 PRRSV 的生物学结构
• 1.3.1.4 PRRSV GP5 蛋白
• 1.3.2 PRRSV 的免疫特性
• 1.3.3 PRRSV 的持续性感染与免疫抑制
• 1.3.4 PRRS 的诊断方法研究进展
• 1.3.4.1 病毒的分离与鉴定
• 1.3.4.2 抗原检测方法
• 1.3.4.3 PRRSV 的分子生物学诊断
• 1.3.4.4 血清学诊断
• 1.3.5 基于GP5 蛋白的疫苗研究进展
• 1.3.5.1 核酸疫苗
• 1.3.5.2 重组多肽疫苗
• 1.3.5.3 活载体疫苗
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株和菌株
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 试剂及试剂盒
• 2.1.4 试验动物
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 溶液及配制
• 2.1.7 RT-PCR 相关物品的处理
• 2.2 方法
• 2.2.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析
• 2.2.1.1 鼠、猪C3d 基因的克隆
• 2.2.1.2 C3d 和pMD18-T 载体的构建
• 2.2.1.3 鼠、猪C3d 基因的测序
• 2.2.1.4 哺乳动物与禽类补体C3d 基因序列的比较分析
• 2.2.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建
• 2.2.2.1 鼠、猪C3d-p28 串联体的构建
• 2.2.2.2 pcDNA3.1-C3d-p28.n（n=2，4，6）的构建
• 2.2.2.3 PRRSV GP5 基因的扩增
• 2.2.2.4 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.n 重组质粒的构建
• 2.2.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究
• 2.2.3.1 重组质粒在Marc145 细胞的表达
• 2.2.3.2 GP5 核酸疫苗免疫小鼠效果检测
• 2.2.3.3 数据处理和分析
• 2.2.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究
• 2.2.4.1 重组质粒pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.2 4 6 的构建
• 2.2.4.2 重组质粒在Marc145 细胞的表达
• 2.2.4.3 invH 重组质粒免疫小鼠效果检测
• 2.2.4.4 数据处理和分析
• 3 结果与分析
• 3.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析
• 3.1.1 鼠、猪C3d 基因克隆的电泳结果
• 3.1.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定
• 3.1.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析
• 3.1.3.1 鼠、猪的C3d 序列
• 3.1.3.2 C3d 基因序列比较分析
• 3.1.3.3 CR2 结合区氨基酸同源性比较
• 3.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建
• 3.2.1 C3d-p28 串联体的构建
• 3.2.1.1 单拷贝C3d-p28 基因克隆
• 3.2.1.2 C3d-p28 串联体的构建
• 3.2.2 RT-PCR 扩增PRRSV GP5 基因
• 3.2.3 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.n 重组质粒的构建
• 3.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究
• 3.3.1 GP5 表达结果
• 3.3.2 安全性检验结果
• 3.3.3 GP5 核酸疫苗的免疫效果
• 3.3.3.1 抗体水平检测结果
• 3.3.3.2 中和抗体测定结果
• 3.3.3.3 IFN-γ含量的测定结果
• 3.3.3.4 IL-4 含量的测定
• 3.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究
• 3.4.1 pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.n 重组质粒的构建
• 3.4.2 invH 表达结果
• 3.4.3 安全性检验结果
• 3.4.4 invH 核酸疫苗的免疫效果
• 3.4.4.1 invH 抗体水平结果
• 3.4.4.2 小鼠血清中IL-4 和IFN-γ的含量
• 3.4.4.3 小鼠攻毒保护试验
• 4 讨论
• 4.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆
• 4.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗构建
• 4.3 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究的意义
• 4.4 鼠C3d 沙门氏菌invH 核酸疫苗构建及免疫效果研究的意义
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况
• 博士学位论文内容简介及自评