论文摘要
我国是乙型肝炎病毒（HBV）感染高发区,乙型病毒性肝炎严重威胁人类的生命健康。依据HBV全基因组序列同源性≥92%或S基因序列同源性≥96%将HBV分为了A-H 8种基因型。HBV的基因型是由长期病毒突变和宿主的筛选累积形成的结果。目前的研究显示,不同基因型HBV在流行病学特征、病毒变异、疾病表现和治疗应答等方面均存在着差异, HBV的基因分型研究对进一步明确乙型肝炎发病机理、提高检测效率、寻找治疗对策和实现流行病学控制具有重要意义。现有的HBV基因分型检测方法主要有测序分型法、型特异性引物PCR基因分型法、PCR-RFLP分型法和单克隆抗体ELISA分型法等。其中,型特异性引物PCR基因分型法是一种简单、快速、经济的分型方法,具有良好的应用价值。型特异性碱基是该分型方法特异性的保证,由于HBV及其基因型的流行具有显著的地域差异性,不同地域HBV基因组上型特异性碱基的分布情况以及不同地域相同基因型HBV的相同型特异性碱基位点的特异度也可能存在差异,因此,直接将国外现有的型特异性引物PCR基因分型法在国内应用缺乏科学依据,评估型特异性引物的设计合理性以及所建立分型体系的地域适用性显得相当重要。但目前尚缺乏系统、有效的型特异性引物设计标准与评估体系,所以改良现有型特异性引物设计标准以及评估体系,明确分型系统的适用地域,建立一套灵敏、准确、快速、经济、国内适用的改良HBV型特异性引物PCR基因分型体系对于国内HBV基因型的相关研究具有重要意义。目的:本研究旨在改进现有型特异性引物PCR基因分型法的引物设计标准与方法评估体系,明确方法的适用地域,建立一种灵敏、准确、快速、经济、国内适用的改良HBV型特异性引物PCR基因分型法。方法:1、改良HBV B、C基因型型特异性引物PCR分型法的建立:自GeneBank数据库中收集已明确基因型的HBV全基因组标准序列,设立型特异性碱基相关的定义与判断标准,利用DNAman软件对标准序列进行比对,得到各型HBV S基因上的所有型特异性碱基,寻找型特异性碱基聚集区,在聚集区上设计型特异性引物,利用标准B、C基因型HBV血清作为阳性模板初步建立B、C基因型HBV型特异性引物PCR基因分型法。开展方法学评价实验,包括PCR反应条件优化、灵敏度实验、重复性实验和特异性实验。利用22例临床样品,将该法与HBV基因分型“金标准”方法测序分型法进行方法比对,同时利用血清样品测序结果对本法进行方法学设计评估。2、两套HBV型特异性引物分型体系的比较:依据参考文献提供的型特异性分型引物建立经典型特异性引物PCR基因分型法（以下简称“经典法”）。利用22例临床样品,将经典法与改良型特异性引物PCR基因分型法（以下简称“改良法”）进行方法学设计和性能的比对。3、改良HBV型特异性引物PCR基因分型法的初步应用:利用改良型特异性引物PCR基因分型法对187例广东省内HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎病人血清进行分型检测。结果:1、利用B基因型HBV S基因上的型特异性碱基（nt321 A, nt324 T,nt330 G）和C基因型HBV S基因上的型特异性碱基（nt293 A, nt294 C, nt300 C）成功建立了改良HBV B、C基因型特异性引物PCR分型法。检测比对血清盘,改良法与测序分型法的检测符合率为100%。国内B基因型HBV S基因上型特异性碱基的分布情况和碱基特异性指标与由收集的标准序列分析得到的B基因型特异性碱基分布情况和碱基特异性指标存在显著性差异（P≤0.05）,而C基因型无显著性差异（P≥0.05）。2、检测比对血清盘,改良法与对照法的结果符合率为86%。3、收集自广东省的187份慢性乙型肝炎病人血清中,改良法成功分型185例、2例扩增未检出。185例已分型样品中B型107例（57.2%）、C型70例（37.4%）、BC混合型8例（4.3%）。结论:本研究成功建立了一种改良HBV型特异性引物PCR基因分型方法,其具有灵敏、准确、快速、经济、国内适用等特点。本改良方法并被初步应用于广东省内HBV基因型流行情况的调查。