猪胸膜肺炎放线杆菌分子流行病学研究

论文题目: 猪胸膜肺炎放线杆菌分子流行病学研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 刁有祥

导师: 崔治中

关键词: 猪胸膜肺炎放线杆菌,点杂交,血清型,毒素型,共感染,原核表达

文献来源: 山东农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 猪传染性胸膜肺炎(Porcine pleuropneumonia)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度传染性、致死性呼吸道病,以急性出血和慢性的纤维素性坏死性胸膜炎病变为主要特征。本病对各种猪均易感,在新引进猪群多呈急性爆发,其发病率和死亡率常在20%以上,最急性型的死亡率可高达80%～100%。该病在我国的发生呈逐年上升趋势,已成为危害养猪业最严重的疾病之一,给我国养猪业造成严重的经济损失。本研究根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计一对引物,扩增特异的650bp 核酸片段,建立了PCR 检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明,12 个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp 特异性的核酸片段,而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR 的最低检出限量为500 个放线杆菌,表明我们建立的PCR 检测方法敏感性高、特异性强。利用建立的PCR 检测方法对22 株从山东省不同地区分离的疑似放线杆菌菌株进行检测,结果14 株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明,病变部位不同,胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同,其中以扁桃体的检出率最高。该方法的建立为胸膜肺炎放线杆菌的诊断和鉴定提供了良好的方法。利用PCR 反应扩增出胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因650bp 的DNA,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的核酸探针。该探针与不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌均能发生特异性杂交,而与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌等细菌的核酸杂交均为阴性。对胸膜肺炎放线杆菌的最低检出限量为10×102个放线杆菌。对疑似胸膜肺炎放线杆菌感染病变组织DNA 检测结果表明,在扁桃体、鼻腔、气管、肺脏均可检测出胸膜肺炎放线杆菌,以扁桃体的检出率最高。该研究为猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断和流行病学调查提供了良好的方法。猪胸膜肺炎放线杆菌有12个血清型,不同国家和地区流行的APP 血清型不同,而不同血清型的APP 所产生的Apx 毒素不同。本研究从山东省不同地区采集的85 份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌(APP)的分离鉴定,采用凝集试验和PCR 方法对分离菌株进行血清型和Apx 毒素型的检测。结果从山东省不同地区分离到20 株分属5 个血清型的胸膜肺炎放线杆菌。其中,血清7 型6

论文目录:

符号说明

中文摘要

Abstract

第一章前言

1 胸膜肺炎放线杆菌病原分子生物学研究

2.猪胸膜肺炎流行病学研究

3.猪胸膜肺炎放线杆菌诊断方法的研究

4.猪传染性胸膜肺炎免疫预防研究

第二章猪胸膜肺炎放线杆菌 PCR 诊断方法的建立与应用

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

1.2 菌株

1.3 PCR 引物

1.4 细菌培养基

1.5 病料

1.6 模板的制备

1.7 PCR 反应条件

1.8 PCR 扩增产物的检测

1.9 PCR 产物的克隆及序列测定

1.9.1 PCR 产物的回收

1.9.2 PCR 产物的连接

1.9.3 BL21 大肠杆菌感受态细胞的制备

1.9.4 连接产物的转化

1.9.5 质粒 DNA 的提取

1.9.6 质粒 DNA 的酶切鉴定

1.9.7 阳性克隆序列测定

1.10 PCR 检测的特异性试验

1.11 PCR 检测的敏感性试验

1.12 PCR 对分离菌株的检测

1.13 PCR 对感染猪病变组织的检测

2 结果

2.1 PCR 检测的特异性试验

2.2 PCR 检测的敏感性试验

2.3 PCR 产物的克隆和序列测定

2.4 PCR 对分离菌株的检测

2.5 PCR 对感染病变组织的检测

3 讨论

第三章地高辛标记探针检测猪胸膜肺炎放线杆菌的研究与应用

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和试剂

1.1.2 菌株

1.1.3 PCR 引物

1.1.4 细菌培养基

1.2 方法

1.2.1 ApxⅣ基因的克隆和序列测定

1.2.1.1 APP 基因组的提取及模板的制备

1.2.1.2 PCR 反应

1.2.1.3 PCR 产物的克隆及序列测定

1.2.2 探针的标记

1.2.3 杂交检测程序

1.2.4 标记探针的特异性试验

1.2.5 标记探针的敏感性试验

1.2.6 标记探针对分离菌株的检测

1.2.7 标记探针对临床病例病变组织的检测

2 结果

2.1 PCR 结果

2.2 PCR 产物的克隆和序列测定

2.3 标记探针的特异性试验

2.4 标记探针的敏感性试验

2.5 标记探针对分离菌株的检测

2.6 标记探针对感染病变组织的检测

3 讨论

第四章猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和试剂

1.1.2 实验动物

1.1.3 菌株

1.1.4 细菌培养基

1.1.5 病料

1.2 方法

1.2.1 病原的分离鉴定

1.2.2 生化特性

1.2.3 PCR 检测

1.2.4 药敏试验

2 结果

2.1 病理变化

2.2 培养特性

2.3 染色镜检

2.4 生化试验结果

2.5 PCR 鉴定结果

2.6 药敏试验结果

3 讨论

第五章猪胸膜肺炎放线杆菌山东分离株的血清型与 APX 毒素型研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和试剂

1.1.2 实验动物

1.1.3 菌株

1.1.4 不同血清型胸膜肺炎放线杆菌阳性血清

1.1.5 PCR 引物

1.1.6 细菌培养基

1.2 方法

1.2.1 血清型鉴定

1.2.2 Apx 毒素型鉴定

1.2.2.1 APP 基因组的提取及模板的制备

1.2.2.2 PCR 反应

1.2.2.3 PCR 产物的克隆及序列测定

1.2.3 致病性试验

2 结果

2.1 血清型鉴定结果

2.2 分离菌株毒素型鉴定结果

2.3 分离菌株毒素基因测序结果

2.4 致病性试验结果

3 讨论

第六章猪传染性胸膜肺炎病料中 PCV-2 和 PRRSV 的 PCR 检测

1 材料和方法

1.1 病料

1.2 仪器和试剂

1.3 PCR 引物

1.4 猪传染性胸膜肺炎肺脏中 PCV-2 的 PCR 检测

1.4.1 样品总 DNA 的提取

1.4.2 PCR 检测

1.5 猪传染性胸膜肺炎肺脏中 PRRSV 的 RT-PCR 检测

1.5.1 样品总 RNA 的提取

1.5.2 RT-PCR 检测

1.6 PCR 产物的克隆及序列测定

1.7 数据处理

2 结果

2.1 病料检测结果

2.2 PCR 产物的克隆和序列测定

2.3 不同地区猪传染性胸膜肺炎病料中 PCV-2、PRRSV 及 PCV-2、PRRSV 共感染的检测

2.4 不同地区临床健康猪组织中 PCV-2 和 PRRSV 的检测

2.5 数据处理结果

3 讨论

第七章猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡA、ApxⅢA、ApxIVA的克隆与表达

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

1.2 菌株

1.3 PCR 引物

1.4 ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA 基因的扩增和克隆

1.5 目的片断和载体的酶切、电泳及回收

1.5.1 目的片断的酶切

1.5.2 pGEX-5X-3 酶切

1.5.3 酶切产物的电泳及回收

1.6 DNA 的连接与转化

1.7 质粒 DNA 的提取与酶切

1.8 重组质粒的诱导表达

1.9 电泳样品制备

1.10 表达产物的 SDS-PAGE

1.11 表达产物的 Western-blotting 检测

2 结果

2.1 ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA 基因 PCR 扩增结果

2.2 重组质粒的鉴定结果

2.3 血清3 型分离菌株 ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA 基因序列分析

2.4 血清3 型分离菌株 ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA 核酸片段的表达及检测

2.5 重组菌裂解产物 Western-blotting 结果

3 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

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发布时间: 2005-10-11

猪胸膜肺炎放线杆菌分子流行病学研究

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