论文摘要
第一部分骨髓间充质干细胞的培养目的探索和建立人骨髓间充质干细胞体外分离和培养的技术方法，鉴定其生物学特性，为进一步建立组织工程血管做准备。方法人骨髓标本来源于30岁左右男性健康志愿者。按骨髓穿刺的常规方法，抽取胸骨骨髓液5ml，肝素抗凝。DMEM培养液稀释后，用人淋巴细胞分离液密度梯度离心法，分离出单个核细胞。用DMEM洗涤，加入DMEM培养液，并加入10％胎牛血清（FCS）。台盼蓝染色检测细胞活力。24小时后，吸取培养液，连同未贴壁细胞弃去。贴壁细胞继续培养，每3天更换半量的培养液，12天后细胞融合时，用0.25％胰蛋白酶／0.02％EDTA消化液消化后，细胞传代，倒置显微镜每天观察生长情况。绘制（P1、P5、P10）生长曲线，并计算原代和前两代传代干细胞的贴壁率。对第三代细胞行CD34的流式细胞仪表型鉴定。结果分离出人骨髓间充质干细胞经台盼蓝染色证实95％以上为活细胞。经过24小时的培养，原代细胞贴壁黏附在培养瓶，换液弃未贴壁细胞，继续培养，细胞呈克隆样生长，12天后细胞融合。倒置相差显微镜观察细胞贴壁生长，细胞呈梭形，排列有明显的方向性。计算原代和前两代间充质干细胞的贴壁率，贴壁率无明显差异。消化传代后细胞生长加速，约8-10天左右细胞即融合，可以消化传代。培养到第四代时，细胞生长倍增稳定。冻存细胞复苏后，存活率达95％以上，增殖能力强，和传代细胞具有相似的生长特性。对第1、5、10代细胞进行生长曲线的测定，结果显示细胞传代培养1-2天细胞变化不大，细胞处于潜伏期。第三天起呈对数生长，至第5天到高峰，之后为平台期。细胞表面CD34表达阴性。结论本实通过分离培养人间充质干细胞和研究其体外培养细胞的生物学特性，为组织工程学带来新的细胞来源。第二部分同种主动脉脱细胞血管基质的制备目的探讨体外主动脉脱细胞的方法，为组织工程血管体的构建提供血管支架。方法取液氮保存的同种主动脉管道。将标本置于Tris低渗缓冲液（PH 8.0，0.1％EDTA和抑肽酶10KIU／ml）4℃下孵育14小时。用含0.1％SDS的Tris低渗缓冲液（PH8.0）37℃下再孵育24小时。转入PBS溶液中清洗，37℃洗涤3次，每次20分钟。用Tris等渗缓冲液（DNase200μg／ml，RNase200μg／ml PH7.6）充分冲洗掉残留细胞，完成脱细胞支架制备。并对脱细胞前后的管壁进行光镜及电镜形态学观察以及进行理化性能测定。数据以（?）±s表示，采用SPSS10.0统计软件分析，两样本均数比较采用配对比较t检验，显著性标准为P＜0.05。结果人主动脉血管壁经SDS法去细胞后，经光镜和电镜观察，脱细胞后血管壁无细胞残留，胶原纤维和弹性纤维保留完整，脱细胞前后热皱缩温度无明显变化（P＞0.05）；去细胞后管壁含水量显著增加，差别有显著性（P＜0.05），去细胞前后管壁厚度无显著性（P＞0.05）（如表1）。结论SDS和消化酶法联合去细胞效果良好，脱细胞前后理化性能没有明显变化，初步制造了同种主动脉血管壁脱细胞基质材料，为构建同种血管管道提供了较合适的支架材料。第三部分骨髓间充质干细胞在血管支架上的种植目的研究人骨髓间充质干细胞在脱细胞血管支架上种植的前景。方法提取人骨髓间充质干细胞经过密度梯度法分离、培养和传代。用SDS和DNase，RNase方法联合脱去动脉壁的细胞，制成血管支架。将培养的人骨髓间充质干细胞种植在支架上。首先将支架用DMEM浸泡24小时，用胎牛血清浸泡12小时，在支架上涂上一层粘连蛋白以增加支架的黏附性。然后再将培养的细胞按一定的浓度分两次种植在支架上，培养7天。在光镜和电镜下观察培养结果。结果标本表面有一层连续的细胞黏附生长，连续性较好，但是未向血管基质内部生长，作为种子细胞的人骨髓间充质干细胞在脱细胞基质上具有铺展和生长能力。骨髓间充质干细胞与脱细胞血管基质支架居有良好的相容性，细胞在支架表面黏附紧密。结论骨髓间充质干细胞种植在SDS法制做的去细胞血管支架上，可在体外生成组织工程血管。