线性基因表达框直接转化体系的优化和瞬时表达

论文摘要

线性DNA直接转化方法因其易操作、转化效率高而且转化受体不受限制等诸多优势在植物基因转化中已被广泛使用,所转化外源基因能够整合、表达并且稳定遗传给后代。线性DNA直接转化系统主要用于稳定转化,而在转化过程中,却存在着转化动力不足的问题。为了提高转化效率,本研究以报告基因smGFP和GUS的线性DNA片段为转化表达框,研究不同物理化学因素包括表面活性剂、渗透处理、钙等处理对线性DNA转化表达框进入细胞核及其在细胞中瞬时表达效率的影响,以期建立一种以线性DNA片段为转化表达框、低成本高效率的瞬时表达直接转化体系,并进一步用于稳定转化体系。通过构建植物smGFP和GUS基因双元表达载体,以洋葱下表皮为实验材料,借助农杆菌瞬时表达系统,研究不同浓度的CaCl2、6-BA、2,4-D、Silwet L-77、DowCorningQ2-5211和渗透处理对瞬时表达效率的影响。SmGFP和GUS基因的瞬时表达结果表明各种物理化学因素在不同程度上促进了农杆菌瞬时表达,且各因素的最佳处理浓度依次为CaCl2,0.5mol/L;6-BA,0.2mg/L;2,4-D,0.2 mg/L;Silwet L-77,0.1‰;DowCorning Q2-5211,0.1‰。通过荧光表达强度和GUS染色分析发现,农杆菌高渗处理能较好的提高转化效率,0.1‰的Dow Corning Q2-5211和Silwet L-77诱导也能提高农杆菌转化效率,但效果较渗透稍差。将农杆菌瞬时表达系统筛选出的各种物理化学因素的最佳浓度用于线性基因表达框的转化。以洋葱下表皮为转化材料,对不同处理的线性smGFP和GUS基因表达框的瞬时表达分时段检测;同时检测FITC和SYBR Green I标记的GUS线性基因表达框转化后在细胞中的定位和荧光强度,并利用流式细胞仪对荧光标记基因进入细胞核的效率进行定量分析。结果表明,洋葱组织块经过高渗处理15～20min后,再在smGFP/GUS线性表达框终浓度为100ng/mL的MS液体培养基中悬浮共培养1.5～2h即能有效的将smGFP/GUS线性基因表达框转化入细胞核内,并在转换后36h左右得到高效的瞬时表达,能快速建立瞬时表达系统。通过荧光标记基因的定位和定量分析,高渗处理是促进线性表达框直接转化的最佳方法。借助洋葱下表皮中优化的瞬时表达体系,将smGFP基因的线性片段转化烟草叶片诱导的愈伤组织。烟草愈伤组织转化后与对照相比有很强的荧光差异。通过高渗转化法处理的转化组愈伤荧光强度最强,且生长状态几乎不受影响,成活率高。通过对转化T0代植株的PCR,RT-PCR,点杂交等分子检测发现,几种直接转化处理均能获得转基因植株,其中高渗转化法获得的转化植株成活率和转化阳性率更高。本文建立的方法适用于外源基因的直接转化,且不受转化受体的影响,在单子叶、双子叶植株、以及组织和细胞中均能应用。通过瞬时和稳定表达优化出高渗直接转化线性基因表达框是国内的首篇报道。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 常用的植物转基因技术及其发展和存在的问题
• 1.1.1 常用的植物转基因技术
• 1.1.2 线性片段转化的研究进展
• 1.1.3 转基因技术的发展和安全隐患
• 1.2 报告基因在植物转基因研究中的应用
• 1.3 瞬时表达系统的研究意义
• 1.4 本实验研究的目的与意义
• 2 直接转化辅助因子的筛选与优化
• 2.1 实验材料和试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂和培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SmGFP和GUS基因植物表达载体的获得
• 2.2.2 SmGFP和GUS基因转化植物材料
• 2.2.3 转基因材料瞬时表达检测
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 农杆菌表达载体的获得
• 2.3.2 渗透压的测定结果
• 2.3.3 转基因材料瞬时表达检测结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 线性基因表达框转化方法优化
• 3.1 实验材料和试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要试剂和培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 引物的合成
• 3.2.2 质粒的提取
• 3.2.3 线性基因表达框的制备
• 3.2.4 线性基因表达框转化方法的优化
• 3.2.5 线性基因表达框转化洋葱表皮
• 3.2.6 GUS基因的组织化学染色
• 3.2.7 洋葱表皮细胞核的提取
• 3.2.8 荧光观察和流式细胞检测
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 线性基因表达框的制备
• 3.3.2 线性基因表达框转化方法的优化结果
• 3.2.3 SmGFP线性基因表达框的瞬时表达
• 3.3.4 GUS基因的瞬时表达
• 3.3.5 外源荧光标记DNA片段在细胞中的定位
• 3.3.6 流式细胞检测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4 线性基因表达框转化烟草
• 4.1 实验材料和试剂
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要试剂和培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 线性基因表达框的制备
• 4.2.2 烟草愈伤组织的诱导
• 4.2.3 烟草愈伤组织的转化
• 4.2.4 SmGFP在烟草愈伤组织中的瞬时表达
• 4.2.5 转smGFP烟草的分子检测
• 4.2.6 PCR检测
• 4.2.7 点杂交检测
• 4.2.8 烟草RNA的提取
• 4.2.9 RT-PCR检测
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 烟草愈伤的诱导结果
• 4.3.2 转化愈伤组织的瞬时表达
• 4.3.3 转化烟草的PCR检测
• 4.3.4 转化烟草点杂交检测结果
• 4.3.5 烟草总RNA的提取结果
• 4.3.6 烟草RT-PCR检测结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录A 培养基配方
• 附录B 电泳用DNA Marker
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢