胰腺癌差异表达microRNAs的鉴定及功能研究

论文摘要

microRNAs（miRNAs）是由21-25个核苷酸组成的非编码RNA,它通过与靶基因的3’-UTR的配对,促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达。近年来,其与各种疾病的关系,尤其是与肿瘤的关系的研究成为热点。胰腺癌是临床上治疗困难的疾病,对人类的健康威胁极大,大量研究工作集中于胰腺癌的肿瘤编码基因的筛查和功能的鉴定,关于miRNAs与此疾病的关系知之甚少,研究miRNAs在胰腺癌发病机制中的作用具有重要的意义。本实验以临床上胰腺癌组织标本和国际上公认的ATCC胰腺癌细胞系Panc-1/Mia PaCa-2为实验对象,用miRNAs芯片筛查胰腺癌组织与正常胰腺组织中差异表达的miRNAs。设定阈值1.5倍,SAM软件分析找到32个差异表达的miRNAs,与对照组比较,其中上调的有18个,下调的有14个。Northern Blotting实验验证了部分的芯片结果：挑选了5个miRNAs分子,其中4个与芯片结果完全一致,一个结果有出入。依据K-RAS改变是胰腺癌中最典型的特征,并且是导致胰腺癌肿瘤恶性行为的一个关键因素,我们检测了胰腺癌细胞系中K-RAS蛋白水平,有文献报道K-RAS基因是let-7的一个靶基因,因此我们又检测了胰腺癌细胞系中let-7 miRNA的水平,发现与K-RAS的蛋白表达水平成负向关系；接着我们用let-7 miRNA直接导入胰腺癌细胞系Panc-1,检测到K-RAS的蛋白水平下降,而K-RAS的mRNA水平无明显变化,说明let-7的降低是胰腺癌中K-RAS蛋白升高的原因之一。我们又检测了胰腺癌细胞系以及正常胰腺组织中miR-96的表达水平,发现其在正常胰腺组织比胰腺癌细胞系中的表达下降。用质粒为载体在Mia PaCa-2细胞中高表达miR-96,结果发现K-RAS的mRNA水平不变、而蛋白水平下降,肿瘤细胞的恶性生物学行为（增殖、克隆形成能力、迁移和侵袭能力）受到了明显的抑制,同时肿瘤细胞凋亡增强；我们又检测了RAS下游通路中的两个重要分子ERK和AKT的表达有显著下降,它们的活化形式phospho-ERK和phospho-AKT也有不同程度的下降。生物信息学分析miR-96的前体序列发现,各物种间存在多个位点核苷酸的多态性,且位于前体的茎环结构区,但是成熟体的序列十分保守（>99%序列相同）,小鼠的miR-96成熟体序列与人的序列完全一致,因此推测miR-96可能是进化过程中保留下来的具有肿瘤抑制功能的重要分子。综合前面的结果,我们得出在胰腺癌中miRNAs的表达存在差异,过表达miR-96能在细胞水平上抑制肿瘤的恶性生物学行为,let-7和miR-96的表达下降是胰腺癌的肿瘤恶性行为发展的一个因素,是阐明胰腺癌肿瘤分子机制的一个重要补充。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 中英文缩略词表
• 前言
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 菌株和细胞株
• 1.3 质粒载体
• 1.4 试剂盒
• 1.5 工具酶及分子量标准
• 1.6 引物序列
• 1.7 放射性同位素
• 1.8 试剂（按试剂公司分类）
• 1.9 主要仪器设备
• 1.10 分析软件
• 2 实验方法
• 2.1 细胞学实验
• 2.2 DNA、RNA及蛋白的提取、目的基因的扩增
• 2.3 重组质粒的操作方法
• 2.4 MIRNA的PAGE/NORTHERN BLOTTING 印迹杂交
• 2.5 WESTERN印迹
• 2.6 免疫荧光染色
• 2.7 REAL-TIME PCR实验
• 2.8 MIRNA芯片
• 2.9 细胞生长情况检测
• 2.10 流式细胞术检测
• 2.10.1 PI法检测细胞周期
• 2.10.2 ANNEXINV与PI双染法检测细胞凋亡
• 2.11 软琼脂克隆形成实验
• 2.12 细胞迁移、体外侵袭能力检测
• 2.13 统计学方法
• 技术路线
• 结果
• 1 胰腺癌病例的临床病理资料
• 2 胰腺癌组织的显微切割
• 3 总RNA的提取
• 4 MIRNA芯片的结果
• 4.1 芯片杂交的扫描图像
• 4.2 MIRNA芯片杂交的差异基因
• 5 NORTHERN BLOTTING验证的结果
• 6 各个细胞系的K-RAS MRNA、蛋白和LET-7的比较
• 7 MIR-96前体序列的多态性
• 8 构建表达MIR-96的载体
• 9 载体表达有效性的验证
• 10 稳定转染细胞系的建立
• 11 细胞生物学行为检测
• 11.1 细胞增殖
• 11.2 无血清培养基中细胞的生长能力
• 11.3 细胞周期
• 11.4 细胞凋亡相关的ANNEXIN V检测
• 11.5 软琼脂生长集落检测
• 11.6 细胞聚集实验
• 11.7 细胞划痕实验
• 11.8 细胞的侵袭能力检测
• 12 MIR-96的表达抑制RAS通路中几个主要信号分子的表达
• 13 MIR-96调节的靶基因验证
• 讨论
• 1 MIRNA差异表达与胰腺癌
• 2 MIR-96在人胰腺癌组织中的表达鉴定和初步功能分析
• 3 MIR-96靶基因寻找
• 4 展望
• 参考文献
• 小结
• 综述
• 参考文献
• 攻读博士期间发表和待发的表文章
• 致谢