宫颈癌HPV蛋白疫苗和肿瘤SP细胞的研究

论文摘要

本论文主要围绕宫颈癌蛋白疫苗和肿瘤SP细胞方面开展研究。宫颈癌（cervical cancer,CC）是全世界女性易患的第二大癌症。研究表明人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染是产生宫颈癌的最主要因素。E6和E7是HPV相关的两类重要的癌蛋白,对于病毒的进入和细胞转化非常重要,在多数HPV相关的肿瘤中均有表达。目前重组载体疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗及蛋白疫苗等均以E6和/或E7作为靶标。由于蛋白质疫苗既不受人类白细胞抗原（human leucocyte antigen,HLA）限制性,又避免了病毒载体或DNA疫苗潜在的安全隐患,是目前公认最安全、有效的疫苗。在宫颈癌蛋白疫苗研究中,我们采用了小鼠宫颈癌模型——TC-1细胞模型,探讨了 HPV16 E6、E7相关蛋白诱导肿瘤细胞特异性免疫反应,抑制TC-1细胞在体内的生长情况,具备潜在的临床应用价值。从人宫颈癌细胞中克隆、构建HPV16E6、E7原核表达质粒,通过拼接PCR获得了 mE7序列,并构建其原核表达质粒,与E7基因不同的是mE7序列第70位碱基突变（T→G）,并去除E7基因终止密码子之前的15bp,以避免E7蛋白的转化活性,使疫苗更安全。将三种重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达,采用镍柱纯化回收E6、E7和mE7蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的蛋白。在肿瘤预防实验中,分别将纯化的E6、E7和mE7蛋白与全弗氏佐剂一起免疫雌性C57BL/6小鼠,结果表明,E7和mE7蛋白免疫的小鼠在接种1×105TC-1细胞后100%避免了肿瘤发生,而对照组小鼠则全部形成肿瘤,与对照组相比较,只有17%E6蛋白免疫的小鼠没有瘤体生长,其生存率也无显著差异,但是肿瘤生长明显减慢,说明E6蛋白也能抑制肿瘤细胞的生长。在肿瘤治疗实验中,TC-1细胞植瘤l0d后用E6、E7和mE7蛋白免疫荷瘤小鼠,结果表明治疗效果不明显。为了进一步地改善肿瘤的治疗效果,研究细胞免疫和体液免疫在抑制肿瘤方面的作用,我们进行了过继免疫实验,小鼠TC-1植瘤10d后,尾静脉注射E7蛋白免疫小鼠的T细胞和血清,结果显示,与对照组相比,T细胞可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,而血清则未引起显著差异。CTL实验结果表明E7蛋白免疫小鼠的T细胞有裂解TC-1细胞的能力。以上结果说明了 E6、E7和新型的mE7蛋白免疫小鼠能够诱导抗肿瘤的保护性免疫,并且细胞免疫在抗肿瘤反应中起着主要作用。HPV16 E6、E7与结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis,MTB）HSP70的融合蛋白E6-E7-HSP70能够引起小鼠抵抗肿瘤细胞的功能,但是异源MTB-HSP70蛋白可能引起小鼠及人体的免疫反应。我们克隆、构建了小鼠自体的HSP70基因以及E7-HSP70融合基因的原核表达载体,转入大肠杆菌Rosetta中诱导表达蛋白,制备包涵体蛋白,并进行了复性,得到可溶的HSP70和E7-HSP70蛋白,免疫雌性C57BL/6小鼠,在没有佐剂的情况下,E7-HSP70蛋白免疫的小鼠在接种了 l×105TC-l细胞后均没有瘤体生长,而对照组HSP70蛋白免疫小鼠则全部形成肿瘤。首次证实,在无需佐剂的情况下,E7与小鼠自体HSP融合蛋白疫苗免疫C57BL/6小鼠,可以对表达E7蛋白的TC-1细胞有抵抗作用。肿瘤干细胞（tumor stem cell,TSC）是肿瘤组织中存在的极少量充当干细胞角色的肿瘤细胞,具有无限增生的潜能,在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用。侧群（side population,SP）细胞是肿瘤组织或细胞中具有TSC性质的一群细胞。在肿瘤SP细胞研究中,我们通过分离小鼠骨髓（bone marrow,BM）细胞,检测其SP细胞含量,确定相应的实验方法,进一步检测并证实几种未经报道的肿瘤细胞系LLC（FO）、PC-12、CaSki和SiHa中含有SP细胞,而来源于LLC（FO）的LLC（F3）细胞中的SP含量明显升高,动物实验的结果表明在原位瘤和转移瘤模型中,LLC（F3）具有更高的转移性能,首次报道小鼠肿瘤细胞LLC中SP细胞含量高可以促进肿瘤的转移。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 综述
• 第一节 HPV及其疫苗的研究进展
• 1 人乳头瘤病毒
• 1.1 HPV的发现及其研究的重要性
• 1.2 HPV的分类
• 1.3 HPV的流行病学
• 1.4 HPV的分子生物学
• 2 HPV疫苗的研究
• 2.1 预防性疫苗
• 2.2 治疗性疫苗
• 参考文献
• 第二节 肿瘤干细胞的研究进展
• 1 肿瘤干细胞理论的提出
• 2 干细胞与肿瘤干细胞
• 2.1 干细胞
• 2.2 肿瘤干细胞
• 3 肿瘤干细胞的分离与鉴定
• 3.1 TSC与白血病
• 3.2 TSC与乳腺癌
• 3.3 TSC与神经系统肿瘤
• 3.4 TSC与侧群细胞
• 4 展望
• 参考文献
• 第二章 宫颈癌HPV16 E6、E7蛋白疫苗的研究
• 前言
• 1 实验材料
• 1.1 质粒、菌株、细胞和小鼠
• 1.2 PCR引物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要溶液
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 引物设计与合成
• 2.3 感受态菌的制备
• 2.4 合成HPV16 E6、E7基因的cDNA
• 2.5 克隆质粒TA-E6、TA-E7的构建
• 2.6 表达质粒pET-28a（+）-E6、pET-28a（+）-E7的构建
• 2.7 拼接PCR扩增HPV16 mE7基因片段
• 2.8 小鼠HSP70 cDNA的扩增及其克隆质粒和表达质粒的构建
• 2.9 表达质粒pET-28a（+）-E7-HSP70的构建
• 2.10 E6、E7和mE7蛋白的诱导表达与鉴定
• 2.11 E6、E7和mE7蛋白的纯化和鉴定
• 2.12 HSP70和E7-HSP70蛋白的诱导表达与鉴定
• 2.13 蛋白预防免疫抗肿瘤模型
• 2.14 蛋白免疫治疗肿瘤模型
• 2.15 小鼠T细胞的提取
• 2.16 过继免疫实验
• 2.17 免疫小鼠血清中抗体滴度的检测
• 2.18 CTL功能检测
• 2.19 统计方法
• 3 实验结果
• 3.1 克隆质粒TA-E6、TA-E7的构建
• 3.2 重组表达质粒pET-28a（+）-E6、pET-28a（+）-E7的构建
• 3.3 克隆质粒TA-mE7和表达质粒pET-28a（+）-mE7的构建
• 3.4 HPV16 E6、E7和mE7蛋白的诱导表达
• 3.5 HPV16 E6、E7和mE7蛋白的纯化
• 3.6 HPV16 E6、E7和mE7蛋白免疫对小鼠体内TC-1细胞生长的影响
• 3.7 克隆质粒TA-HSP70的构建
• 3.8 克隆质粒TA-E7（无终止密码子）的构建
• 3.9 重组质粒pET-28a（+）-HSP70和pET-28a（+）-E7-HSP70的构建
• 3.10 HSP70和E7-HSP70蛋白的诱导表达
• 3.11 HSP70和E7-HSP70蛋白的纯化和鉴定
• 3.12 E7-HSP70蛋白预防免疫抑制小鼠体内TC-1细胞生长
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 肿瘤SP细胞的研究
• 前言
• 1 实验材料
• 1.1 细胞和小鼠
• 1.2 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 提取小鼠骨髓细胞
• 2.2 细胞培养
• 2.3 SP细胞的检测
• 2.4 LLC（FO）和LLC（F3）细胞的皮下原位瘤模型
• 2.5 LLC（FO）和LLC（F3）细胞的实验转移瘤模型
• 3 实验结果
• 3.1 BM细胞中的SP细胞
• 3.2 肿瘤细胞中SP细胞的检测
• 3.3 LLC（FO）和LLC（F3）细胞的皮下原位瘤模型
• 3.4 LLC（FO）和LLC（F3）细胞的实验转移瘤模型
• 4 讨论
• 参考文献
• 小结
• 致谢