论文摘要
肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是指肝脏对各种急慢性损伤的一种修复反应,是多种慢性肝病发展至肝硬化共有的病理改变和必经阶段,在一定情况下是可逆转的。其特征是进行性的细胞外基质（exracellular matrix,ECM）积聚和组织结构重塑,最终结果是导致肝硬化直至肝功能衰竭。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）是肝纤维化时ECM的主要来源细胞,其活化是肝纤维化发生的核心环节,它激活后可导致自身增殖及胶原合成增加。肝硬化是纤维化的最后阶段,普遍认为是不可逆的。所以努力找出形成纤维化的最初诱因是治疗纤维化的有效方法。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）是近年发现的一种与细胞内信号传导有关的脂类第二信使,它与多种生物学事件有关,如细胞骨架重组、细胞存活、肿瘤发生、细胞凋亡等。PI3K激活后可产生多种脂质产物,这些脂质产物与蛋白激酶B（protein kinase B,PKB,Akt）的PH区结合,不仅导致Akt发生从胞浆到质膜的转位,还可促使其构象发生改变,从而使其Ser473和Thr308位点磷酸化而得以激活。激活的Akt可以通过不同的底物对细胞的生长、分化、增殖及代谢进行调控。研究表明PI3K/Akt信号通路参与了心、肺、肾、肝等多种组织器官纤维化的形成过程,但迄今为止,PI3K在肝纤维化中作用机制,特别是其与HSCs分化和增殖及胶原沉积的关系研究较少。近年来,关于肝纤维化发病机制及其防治的研究已成为国内外医学、生物学研究的热点之一。目前尚无抗肝纤维化的特效药,越来越多的学者把目光投向中医药的开发和利用上,其研究已进入细胞分子水平。扶正化瘀方由丹参、发酵虫草菌粉、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子等药物组成,有活血化瘀、益精养肝等功效。大量药理研究证实其具有保护肝细胞、抗脂质过氧化、抑制促肝纤维化细胞因子生成、抑制肝星状细胞增殖、促进活化肝星状细胞凋亡、抑制胶原合成与分泌、促进胶原降解等作用。为此,本研究应用四氯化碳腹腔注射法建立大鼠肝纤维化模型,探讨PI3K在肝纤维化过程中的动态表达及其与HSCs激活和增殖及胶原沉积的关系;并应用扶正化瘀方灌胃进行干预,探讨其抗肝纤维化的作用机制。目的:研究PI3K在肝纤维化过程中的动态表达及其与HSCs激活和增殖及胶原沉积的关系,并探讨扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制。方法:选用健康雄性Wistar大鼠90只,体重180～200g,适应性喂养1周后,按随机数字表法将其随机分为正常对照组、肝纤维化模型组和扶正化瘀干预组。对照组予以生理盐水腹腔注射（0.2ml/100g）,每周2次,共8周;模型组给予30%的四氯化碳橄榄油溶液腹腔注射（0.2ml/100g）,每周2次,共8周,8周后停止注射,观察至14周;干预组造模方法同模型组,于腹腔注射的同时予以扶正化瘀方药液灌胃（2ml/100g,含扶正化瘀方生药0.046g/ml）,每日1次,共8周。分别于第4、6、8、10、12、14周末取模型组大鼠6只,对照组大鼠3只,于4、6、8周末随机取干预组大鼠6只,水合氯醛麻醉后处死,心脏采血,4℃离心后分离血清,用于ALT、AST检测;留取部分新鲜肝组织,10%中性甲醛固定,石蜡包埋,用于常规HE、Masson染色和免疫组织化学染色;另一部分新鲜肝组织液氮冷冻后,-80℃冰箱保存,用于Western Blot、RT-PCR、肝组织羟脯氨酸等检测。结果:1大鼠一般情况:对照组大鼠精神状态良好,活动自如,毛发整齐有光泽,食欲好,每周体重增加正常。模型组大鼠随着注射四氯化碳时间的延长,逐渐出现精神萎靡,毛发紊乱,失去光泽,食欲下降,体重增长变缓或不增长,个别变得易激惹,具有攻击性;停用四氯化碳后上述状态渐改善。干预组出现精神不振、毛发紊乱、食欲下降、体重增长缓慢等症状较模型组晚,造模第8周时相对症状较轻,平均体重增长大于模型组。2血清ALT、AST改变:对照组大鼠第4、6、8、10、12、14周末血清ALT、AST水平均无明显差异。模型组大鼠第4、6、8、10、12、14周末血清ALT水平分别为:76.31±8.16 U/L、137.56±9.48 U/L、262.96±12.16 U/L、167.04±10.95 U/L、104.30±10.95 U/L、39.36±6.95 U/L,均高于对照组（21.35±4.73 U/L）,且各时间点之间均有明显差异（P<0.05）;AST分别为:191.69±9.61 U/L、375.04±11.63 U/L、528.09±12.46 U/L、397.23±10.92 U/L、164.38±8.81 U/L、92.65±7.30 U/L,亦均高于对照组（26.62±7.16 U/L）,且各时间点之间亦均有明显差异（P<0.05）。扶正化瘀干预组大鼠第4、6、8周末ALT分别为:48.16±7.10 U/L、100.45±9.20 U/L、144.11±11.36 U/L,均高于对照组（21.35±4.73 U/L）,但均明显低于模型组相同时间点数值,且各时间点之间均有明显差异（P<0.05）;AST分别为:113.05±8.32 U/L、235.45±7.85 U/L、312.24±13.16 U/L,均高于对照组（26.62±7.16 U/L）,但均明显低于模型组相同时间点数值,且各时间点之间亦均有明显差异（P<0.05）。3 HE及Masson染色:对照组大鼠肝组织中肝小叶结构完整,肝索排列整齐,无炎症细胞浸润,未见纤维组织增生,无假小叶形成。模型组随造模时间延长,肝细胞由水肿、脂肪变性向坏死进展,8周末汇管区有大量胶原纤维增生,有假小叶形成,8周后停止四氯化碳注射后大鼠肝组织纤维化程度渐减轻。干预组大鼠肝组织炎症、纤维化程度均低于相同时间点模型组大鼠肝组织病变。4α-SMA免疫组织化学染色:对照组大鼠肝组织α-SMA仅在血管壁平滑肌细胞中有少量阳性表达,α-SMA阳性光密度值在不同时间点无明显差异。模型组随着纤维化的进展,肝组织中α-SMA阳性表达细胞逐渐增多;停用四氯化碳后随着时间延长,α-SMA阳性表达细胞逐渐减少。相同时间点干预组α-SMA阳性表达量较模型组少。模型组第4、6、8、10、12及14周末α-SMA阳性光密度值（1.17±0.06、2.55±0.09、3.86±0.11、3.65±0.09、2.82±0.08、1.18±0.08）及干预组第4、6、8周末α-SMA阳性光密度值（0.81±0.08、2.12±0.11、3.52±0.08）均显著高于对照组（0.52±0.08）,P<0.05;且各组相同时间点之间均有明显差异（P<0.05）,模型组和干预组组内第4、6、8周末不同时间点间,及模型组第10、12、14周末各时间点间均有明显差异（P<0.05）。5 PI3K免疫组织化学染色:PI3K免疫组化染色阳性细胞为胞浆内表达棕黄色颗粒。对照组肝组织中仅见少量阳性细胞分布,不同时间点其表达无明显差异。模型组前8周随着纤维化的进展,肝组织中PI3K阳性表达细胞逐渐增多;停用四氯化碳后随着时间延长,PI3K阳性表达细胞逐渐减少。相同时间点干预组PI3K阳性表达量较模型组少。模型组第4、6、8、10、12及14周末PI3K阳性光密度值（0.84±0.06、1.92±0.14、3.01±0.09、2.70±0.09、2.38±0.13、1.19±0.10）及干预组第4、6、8周末PI3K阳性光密度值（0.56±0.08、1.58±0.11、2.54±0.10）均显著高于对照组（0.27±0.05）,P<0.05;且各组相同时间点之间均有明显差异（P<0.05）,模型组和干预组组内第4、6、8周末不同时间点间,及模型组第10、12、14周末各时间点间亦有明显差异（P<0.05）。6 PI3K mRNA表达情况:应用RT-PCR技术检测各实验组大鼠肝组织中PI3K mRNA的表达。对照组PI3K mRNA表达在各时间点间无明显差异。模型组PI3K mRNA表达随着造模时间的延长逐渐增多,停用四氯化碳后表达渐减少。相同时间点干预组PI3K mRNA表达量较模型组少。模型组第4、6、8、10、12、14周末肝组织中PI3K mRNA表达量（0.88±0.07、1.63±0.03、2.26±0.06、1.95±0.07、1.51±0.11、1.16±0.11）及干预组第4、6、8周末PI3K mRNA表达量（0.78±0.09、1.49±0.09、1.97±0.10）均高于对照组（0.63±0.08）,P<0.05;且各组相同时间点之间均有明显差异（P<0.05）,模型组和干预组组内第4、6、8周末不同时间点间,及模型组第10、12、14周末各时间点间亦有明显差异（P<0.05）。7 Western Blot结果显示:实验大鼠肝组织中PI3K蛋白表达与mRNA表达一致。对照组PI3K蛋白表达在各时间点间无明显差异。模型组PI3K蛋白表达随着造模时间的延长逐渐增多,停用四氯化碳后表达渐减少。相同时间点干预组PI3K蛋白表达量较模型组少。模型组第4、6、8、10、12、14周末肝组织中PI3K蛋白表达量（0.66±0.08、0.96±0.08、1.54±0.08、1.24±0.09、0.99±0.11、0.76±0.11）及干预组第4、6、8周末PI3K蛋白表达量（0.56±0.09、0.85±0.07、1.37±0.11）均高于对照组（0.32±0.05）,P<0.05;且各组相同时间点之间均有明显差异（P<0.05）,模型组和干预组组内第4、6、8周末不同时间点间,及模型组第10、12、14周末各时间点间亦有明显差异（P<0.05）。8碱水解法测肝组织中HYP含量显示:对照组HYP含量在各时间点间无明显差异。模型组HYP含量随着造模时间的延长逐渐增多,停用四氯化碳后渐减少。相同时间点干预组HYP含量较模型组少。模型组第4、6、8、10、12、14周末肝组织中HYP（203.50±22.69、378.00±17.00、471.17±17.60、436.67±17.71、386.33±14.06、302.00±30.18 ug/g）及干预组4、6、8周末HYP（152.67±11.14、322.00±17.97、399.67±17.97ug/g）均高于对照组（110.50±18.62ug/g）,P<0.05;且各组相同时间点之间均有明显差异（P<0.05）,模型组和干预组组内第4、6、8周末不同时间点间,及模型组第10、12、14周末各时间点间均有明显差异（P<0.05）。结论:1大鼠经四氯化碳腹腔注射8周可建立典型肝纤维化模型,此模型组织病理学符合人类肝纤维化病理进展特点。2随着肝纤维化进展,肝组织中PI3K蛋白及mRNA表达逐渐增加,增加程度与肝纤维化进展程度一致;而随着肝纤维化的自发逆转,肝组织中PI3K蛋白及mRNA表达逐渐下降,下降程度与肝纤维化逆转程度一致。3扶正化瘀方可减轻四氯化碳引起的大鼠肝损伤,延缓纤维化进展,具有预防肝纤维化的作用。4扶正化瘀方可能是通过阻断PI3K/Akt信号通路而发挥预防肝纤维化的效果。