早实枳3个FT类似基因的异位表达分析

论文摘要

高等植物在种子萌发后需要经历一定时间的营养生长,即童期,才能进入生殖发育阶段。童期的发育机理一直是木本植物育种中备受瞩目的问题,尤其是对一些具有重要经济价值的林木和以收获果实为目的的果树来说尤为重要。20世纪70年代末在我国发现了一株早花的枳壳突变体早实枳（precocious trifoliate orange, Poncirus trifoliata（L.）Raf.）,该突变体在播种后1-2年开花,并且与普通枳不同,能在一年内多次开花。本实验室从早实枳中克隆成花调控基因FT基因时,分离到数条序列类似、长短不同的FT类似基因。本研究试图以烟草和草莓为材料,通过转基因异位表达,对类似基因的功能进行分析,主要研究结果如下：1.通过农杆菌介导转基因的方法得到异位表达的PtFT1烟草阳性植株,获得阳性苗42株。PtFT1即为PtFT的全长cDNA,被广泛用于早花实验,该基因在拟南芥和柑橘中的转化植株皆得到理想的实验结果,即明显早花。本实验中PtFT1的阳性烟草植株在长日照下具有早花表型,但早花现象不明显,仅比野生型烟草提早10d左右。表明PtFT1具有使烟草提早开花的功能。2.通过农杆菌介导转基因的方法转化得到PtFT2阳性植株,获得阳性苗11株。PtFT2中包含PtFT全长序列中除第一个内含子外的全部核酸序列,其中包含一段提前转录终止的冗余片段。PtFT2的阳性植株在长日照下早花表型非常明显,较野生型提前至少100d,这一现象与前人的研究结果中未出现。表明PtFT2具有使烟草提早开花的功能,且冗余片段可能具有自身调节PtFT表达上调的功能。3.通过农杆菌介导转基因的方法转化得到PtFT3阳性植株,获得阳性苗20株。PtFT3是在PtFT2的基础上敲除冗余片段得到的基因片段。PtFT3的阳性植株在长日照下也具有早花表型,其开花时间和PtFT1的时间一致。表明PtFT3也具有使烟草提早开花的功能,证明了冗余片段确实对烟草的开花时间有重要的调控作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 影响植物从营养生长向生殖发育转变的因素
• 1.2.1 影响成花的因素
• 1.2.1.1 温度和光照诱导
• 1.2.1.2 植物营养代谢作用
• 1.2.1.3 植物生长调节剂
• 1.3 植物生殖发育转变的促进途径
• 1.3.1 光周期途径（photoperiodic pathway）促进成花转变的研究
• 1.3.2 春化途径（vernalization pathway）促进成花转变的研究
• 1.3.3 自主途径（autonomous pathway）促进成花转变的研究
• 1.3.4 赤霉素途径（Gibberellin,GA pathway）促进成花转变的研究
• 1.4 促进植物成花转变的基因研究
• 1.4.1 成花相关基因的研究
• 1.4.2 FT/TFL1/MFT基因家族
• 1.4.3 早花基因FT的功能
• 1.4.3.1 FT基因的研究发展史
• 1.4.3.2 本实验对FT基因的研究
• 1.4.4 TFL1基因的功能研究
• 1.4.5 MFT基因的功能研究
• 1.5 本实验研究的内容和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 农杆菌材料
• 2.1.3 质粒材料
• 2.1.4 实验主要试剂和引物
• 2.1.5 实验用各种培养基的配方
• 2.1.5.1 烟草培养基配方
• 2.1.5.2 草莓培养基配方
• 2.2 实验方法
• 2法）'>2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.2.2 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.3 载体构建
• 2.2.3.1 载体构建的引物设计
• 2.2.3.2 质粒载体pBI121酶切
• 2.2.3.3 目的基因片段PtFT的酶切
• 2.2.3.4 酶切产物的回收
• 2.2.3.5 pBI121载体和PtFT基因片段的链接
• 2.2.3.6 大肠杆菌感受态转化
• 2.2.3.7 转化后产物的PCR检测
• 2.2.3.8 转化产物PCR检测后的测序
• 2.2.3.9 大肠杆菌中质粒的提取
• 2.2.3.10 农杆菌感受态转化
• 2.2.3.11 对转化农杆菌感受态后的菌液进行阳性检测
• 2.2.4 预转化外植体材料的制备
• 2.2.5 农杆菌介导的烟草转化
• 2.2.5.1 农杆菌侵染菌液的制备方法
• 2.2.5.2 烟草外植体的准备
• 2.2.5.3 烟草叶片侵染与共培养
• 2.2.5.4 转化后烟草叶片筛选及生根培养
• 2.2.6 转基因烟草苗的初步分子生物学检测
• 2.2.6.1 转基因烟草基因组DNA提取
• 2.2.6.2 转基因烟草材料的PCR鉴定
• 2.2.7 转基因烟草的移栽
• 2.2.8 转基因烟草的转录水平检测
• 2.2.8.1 烟草基因组RNA的提取
• 2.2.9 烟草基因组RNA质量检测
• 2.2.10 提取RNA的纯化
• 2.2.11 RNA的反转录
• 2.2.12 反转录产物的PCR检测
• 2.2.13 农杆菌介导的草莓转化
• 2.2.13.1 草莓外植体的准备
• 2.2.13.2 草莓叶片侵染与共培养
• 2.2.13.3 转化后草莓苗筛选及生根培养
• 2.2.14 草莓基因DNA的提取与目的基因检测
• 3 结果与分析
• 3.1 PtFTl、PtFT2和PtFT3的序列分析
• 3.1.1 PtFT的保守性分析
• 3.1.2 PtFT的全序列分析
• 3.1.3 PtFT1、PtFT2和PtFT3序列差异性分析
• 3.2 PtFT1、PtFT2和PtFT3转化烟草和转化材料分子鉴定
• 3.2.1 烟草转农杆菌目的基因的分化生长过程
• 3.2.2 烟草农杆菌转PtFT系列基因植株的阳性率PCR检测
• 3.2.3 烟草转农杆菌目的基因叶片的RNA检测
• 3.2.4 烟草转农杆菌目的基因的反转录PCR检测
• 3.2.5 转基因烟草的表型分析
• 3.2.6 转基因烟草的表型差异性分析
• 3.3 PBI121载体构建
• 3.3.1 pBI121载体构建的载体及其目的基因的酶切
• 3.3.2 pBI121载体构建的大肠杆菌目的基因PCR检测
• 3.3.3 pBI121载体构建的农杆菌目的基因PCR检测
• 3.4 草莓无菌体系及其转化体系的建立
• 3.4.1 草莓无菌体系的建立
• 3.4.2 草莓农杆菌转化体系的建立
• 3.4.2.1 用于农杆菌转基因的草莓品种选取
• 3.4.2.2 草莓分化培养基的优化
• 4 讨论
• 4.1 PtFT在进化上高度保守
• 4.2 PtFT1/PtFT2/PtFT3转基因烟草的表型变化
• 4.3 PtFT冗余片段的功能分析
• 参考文献
• 附录
• 致谢