TGEV纤突糖蛋白保护性抗原基因克隆、测序及表达

论文摘要

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of pigs，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪对本病都易感，2周龄以内的仔猪具有高度感染性，以仔猪呕吐、严重腹泻和脱水为主要临床特征，致死率可达100％。本病常常由于混合感染和细菌继发感染，难以确诊，缺乏有效疫苗，给各国养猪业带来极大危害。对TGEV的研究表明，S基因编码的S蛋白，是诱导机体产生中和抗体和提供黏膜免疫保护作用主要的结构蛋白。其上的重要保护性抗原位点A、D，在诱导机体产生中和抗体中起关键作用。A位点缺失可导致S蛋白不能产生中和抗体，丧失黏膜免疫保护功能。D位点在中和抗体产生中也起着重要的作用。由此可见，对于S基因重要保护性抗原位点A、D基因的克隆及表达的研究就显得尤为重要。本研究根据Genbank上发表的TGEV-TH-98株S基因cDNA序列，设计并合成了一对扩增A、D位点的引物P1，P2。将自行分离的TGEV-JL毒株接种于单层PK-15细胞增殖病毒。提取TGEV-JL株基因组RNA，通过RT-PCR扩增出含A、D两抗原位点的目的片段S1基因，片段大小为1218bp。将S1基因克隆到pMD18-T克隆载体，构建成重组质粒pMD18-S1。对pMD18-S1进行鉴定后，再将S1基因亚克隆到pET-32a原核表达载体的EcoRⅠ和SalⅠ之间的多克隆位点上，进而构建了重组原核表达质粒pET-S1。将重组表达质粒pET-S1转化到表达宿主菌BL21中，用终浓度为1mmol／L的IPTG对宿主表达菌诱导表达。经SDS-PAGE分析表达产物，结果表明：S1基因在原核表达系统pET-32a中获得表达，表达的重组蛋白大小约为44KD。Western-blot检测表明，表达的重组蛋白能够被TGEV阳性血清所识别。由此说明，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。上述结果提示，克隆的S1基因读码框架正确，可在乳酸杆菌中得到表达，为下一步构建乳酸杆菌穿梭表达载体，研制乳酸杆菌基因工程疫苗奠定基础。同时，该原核表达载体的构建及表达成功，为TGE诊断研究奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 一、猪传染性胃肠炎研究展
• 1 病原学
• 1.1 病毒的分类地位
• 1.2 TGEV的形态和理化特性
• 1.2.1 TGEV的形态特征
• 1.2.2 TGEV的理化特性
• 1.3 TGEV的培养特性
• 1.4 TGEV的病原性
• 1.4.1 组织嗜性
• 1.4.2 病毒受体
• 1.5 TGEV的抗原性、变异性
• 1.6 TGEV的免疫特性
• 2 发病机理
• 3 临床症状和病理变化
• 4 诊断
• 二、TGEV的分子生物学特性
• 2.1 TGEV基因组结构
• 2.2 TGEV基因的复制与转录
• 2.3 TGEV的蛋白结构与功能
• 2.3.1 非结构蛋白
• 2.3.2 TGEV结构蛋白
• 三、TGEV疫苗研究现状
• 3.1 基因工程苗
• 3.1.1 重组亚单位疫苗
• 3.1.2 基因工程活载体疫苗
• 3.1.3 核酸疫苗
• 3.2 转基因植物疫苗
• 3.3 干酪乳杆菌疫苗
• 四、本研究的目的和意义
• 研究部分
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒与细胞
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 载体
• 1.1.4 工具酶
• 1.1.5 核酸及蛋白质分子量标准
• 1.1.6 试剂盒
• 1.1.7 主要试剂
• 1.1.8 主要溶液
• 1.1.9 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 病毒的培养与收获
• 1.2.2 TGEV-JL株病毒总RNA的提取
• 1.2.3 TGEV-JL株重要保护性抗原位点A、D基因的PCR扩增
• 1.2.4 PCR产物的克隆及鉴定
• 1的基因序列的测定与分析'>1.2.5 pMD18-S₁的基因序列的测定与分析
• 1基因原核表达载体的构建'>1.2.6 S₁基因原核表达载体的构建
• 1.2.7 重组表达菌的诱导表达
• 1.2.7.1 SDS-PAGE分析
• 1.2.7.2 Western-blot检测
• 2 结果
• 2.1 细胞病变结果
• 1的PCR扩增结果'>2.2 TGEV-JL株A、D抗原位点基因S₁的PCR扩增结果
• 1的酶切鉴定结果'>2.3 重组质粒pMD18-S₁的酶切鉴定结果
• 1的PCR鉴定结果'>2.4 重组质粒pMD18-S₁的PCR鉴定结果
• 1基因的序列测定与分析结果'>2.5 pMD18-S₁基因的序列测定与分析结果
• 1的酶切鉴定结果'>2.6 重组表达质粒pET-S₁的酶切鉴定结果
• 1的PCR鉴定结果'>2.7 重组表达质粒pET-S₁的PCR鉴定结果
• 1基因表达产物的SDS-PAGE和Western-blot检测结果分析结果'>2.8 S₁基因表达产物的SDS-PAGE和Western-blot检测结果分析结果
• 3 讨论
• 1基因的重要作用'>3.1 S₁基因的重要作用
• 3.2 关于RNA的提取
• 3.3 关于RT-RCR扩增
• 1基因的序列分析'>3.4 S₁基因的序列分析
• 1基因的原核表达'>3.5 S₁基因的原核表达
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历