钝齿棒杆菌N-乙酰谷氨酸激酶编码基因argB的克隆表达研究

论文摘要

L-精氨酸是人体和动物体内的半必需氨基酸,也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物,在医药工业上具有广泛的用途,另一方面,L-精氨酸也是食品营养、化妆品或特殊治疗用途的重要原料。近年来,随着我国经济的发展,人民生活水平的逐步提高,人们对健康方面给于越来越多的关注,L-精氨酸的需求量也在逐年上升。论文以钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA为研究菌株,依据现已知的C.crenatum产精氨酸代谢途径利用遗传工程手段研究分析C.crenatum SYPA合成精氨酸的关键酶N-乙酰谷氨酸激酶（NAGK）的性质和作用及NAGK在C.crenatum SYPA中的加强表达对其对产精氨酸的影响。钝齿棒杆菌C. crenatum SYPA是革兰氏阳性工业用菌株,其合成精氨酸的关键酶NAGK是由基因argB编码,由于钝齿棒杆菌的遗传表达体系的研究报道甚少,本论文构建了pET-28a-argB、pJC1-tac-argB、pC2-argB三个表达质粒并成功在大肠杆菌中表达且进行了酶的活性研究。结果发现,表达质粒pET-28a-argB在大肠杆菌中表达量最高,pJC1-tac-argB次之,pC2-argB表达量最小。同时利用argB的表达载体pET-28a上含有His6·Tag组氨酸标签的特点,采用Ni-NTA柱亲和层析法对目标蛋白NAGK进行了纯化,纯化获得的重组NAGK的比酶活达0.73 U/mg,纯化倍数达6.61。同时对纯化得到的重组NAGK酶学性质进行了初步研究,结果表明:NAGK的最适温度为30℃,最适pH为9.0～9.5,对底物N-乙酰谷氨酸的Km值为3.35 mmol/L.金属离子Cu2+、Mn2+、螯合剂对乙酰谷氨酸激酶均有明显的抑制作用。本文成功将表达质粒pJC1-tac-argB、pC2-argB通过电击转化方法转入C.crenatum SYPA中,由于pET-28a-argB无法通过该方法转入C.crenatum SYPA并表达且pC2-argB表达量较小,因此实验以pJC1-tac-argB为研究对象。本实验挑取了8个钝齿棒杆菌转化子C.C（pJC1-tac-argB）并通过摇瓶发酵挑选出精氨酸产量最高的转化子C.C2,对其NAGK进行了酶活和发酵特性做了初步分析。C.C2中NAGK的酶活为44.5mU/mg,与出发菌株C.crenatum SYPA中NAGK的酶活31.2mU/mg相比提高了约42.6%;精氨酸产量达35.8 g/L与出发菌株C.crenatum SYPA的29.8g/L相比提高了约23.4%,但却发现NAGK的过量表达影响到了菌体的正常生长,生长相对缓慢。通过氨基酸自动分析仪对发酵液中氨基酸的定量分析,证明了NAGK的过量表达明显的促进了前体物质谷氨酸的利用率并促使谷氨酸的代谢流大量流向精氨酸生成的途径,提高精氨酸的产量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 L-精氨酸生物学意义及其应用
• 1.1.1 L-精氨酸的生物学意义
• 1.1.2 L-精氨酸的医疗作用
• 1.1.3 L-精氨酸的其它作用及用途
• 1.2 L-精氨酸生产现状
• 1.3 L-精氨酸在传统诱变育种方面的研究进展
• 1.4 L-精氨酸在基因工程育种方面的研究进展
• 1.5 代谢工程
• 1.5.1 L-精氨酸的生物合经成途径
• 1.5.2 L-精氨酸的分解代谢途径
• 1.6 N-乙酰谷氨酸激酶的研究进展
• 1.7 本课题的立题意义与研究内容
• 1.7.1 立题意义
• 1.7.2 立题内容
• 第二章 钝齿棒杆菌乙酰谷氨酸激酶编码基因ARGB 的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 培养基及培养条件
• 2.1.4 工具酶及其它试剂
• 2.1.5 质粒DNA 的提取
• 2.1.6 基因组DNA 的提取
• 2.1.7 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.1.8 N-乙酰谷氨酸激酶基因的克隆及表达质粒的构建
• 2.1.9 目的蛋白的诱导表达
• 2.1.10 蛋白SDS-PAGE 分析
• 2.1.11 蛋白含量测定
• 2.1.12 NAGK 活性测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 N-乙酰谷氨酸激酶基因argB 的克隆
• 2.2.2 大肠杆菌表达质粒的构建
• 2.2.3 argB 基因在大肠杆菌中的表达
• 2.3 本章 小结
• 第三章 N-乙酰谷氨酸激酶的纯化及其酶学性质的初步研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 培养基及培养条件
• 3.1.4 N-乙酰谷氨酸激酶的纯化
• 3.1.5 N-乙酰谷氨酸激酶的酶活测定
• 3.1.6 蛋白质含量测定
• 3.1.7 N-乙酰谷氨酸激酶活性研究
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 重组蛋白NAGK 的纯化
• 3.2.2 重组NAGK 酶的最适温度及温度稳定性
• 3.2.3 重组NAGK 酶的最适pH 及pH 稳定性
• 3.2.4 金属离子对NAGK 的活性影响
• 3.2.5 酶对底物N-乙酰谷氨酸的动力学分析
• 3.3 本章 小结
• 第四章 N-乙酰谷氨酸激酶基因ARGB 在钝齿棒杆菌中的表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 工具酶及试剂
• 4.1.5 钝齿棒杆菌感受态细胞的制备与电转化
• 4.1.6 菌体生长的测定
• 4.1.7 发酵液中还原糖的测定
• 4.1.8 精氨酸的测定
• 4.1.9 培养条件
• 4.1.10 钝齿棒杆菌的酶活测定
• 4.1.11 钝齿棒杆菌重组菌株与原始菌株的发酵特性比较
• 4.1.12 重组钝齿棒杆菌质粒稳定性研究
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 重组钝齿棒杆菌的构建、筛选及鉴定
• 4.2.2 重组钝齿棒杆菌C.C（ pJC1-tac-argB）中NAGK 酶活的检测分析
• 4.2.3 重组钝齿棒杆菌转化子的摇瓶发酵
• 4.2.4 重组钝齿棒杆菌C.C2 与出发株C. crenatum SYPA 的发酵特性比较
• 4.2.5 C.C2 与出发菌株C. crenatum SYPA 发酵液氨基酸色谱仪分析对比
• 4.2.6 重组钝齿棒杆菌质粒稳定性研究
• 4.3 本章 小结
• 结论与展望
• 主要结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文