RNA干扰Pael-R基因表达对PD模型细胞凋亡的影响

论文摘要

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是第二大类神经系统变性疾病,其重要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元凋亡变性。引起多巴胺神经元凋亡的原因十分复杂,至今仍未彻底明了,但普遍认为与遗传缺陷和/或环境毒素作用有关。现已确定13个PD相关的基因,并证实其中5个基因（Parkin,DJ-1,α-synuclein,PINK1、LRRK2）的遗传突变分别导致了家族性PD的发生。进一步研究发现,泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasomalsystem,UPS）受损导致的胞内异常蛋白聚集可能是多巴胺神经元凋亡的关键因素之一,而Parkin基因编码的Parkin蛋白作为UPS中重要的E3连接酶,其与神经元内异常蛋白聚集进而诱发细胞凋亡的过程密切相关,因此Parkin蛋白及其毒性底物也随之成为研究的热点。研究表明,Parkin蛋白在细胞中的作用底物主要有五种:Pael-R（Parkin-associated endothelin receptor-like receptor,Parkin相关内皮素受体样受体）,α-synuclein,Synphilin-1,CDCrel-1和cyclinE。Pael-R是B型内皮素受体的同源体,Pael-R mRNA在纹状体和黑质的分布最为丰富;Pael-R蛋白若过度表达会变得不溶,并且在细胞内异常聚积,引起内质网的未折叠蛋白反应,最终诱发细胞凋亡。它的代谢依赖于Parkin蛋白介导的泛素化和蛋白酶体降解。在常染色体隐性遗传青少年型帕金森病（autosomal recessive juvenile Parkinsonism,AR-JP）患者中,由于Parkin基因突变导致Parkin蛋白的E3酶活性丧失,致其毒性底物如Pael-R、a-Sp22在胞内大量聚集,最终引起细胞凋亡。因此我们推测,在Parkin基因突变的情况下如果下调Pael-R表达可能会减轻后者异常聚集导致的细胞毒性,从而延缓细胞凋亡。同时许多证据显示,环境毒素损伤亦参与了多巴胺能神经元凋亡变性的过程,这可能是引发PD的另一重要发病机制。鱼藤酮作为一种广泛使用的农业杀虫剂,其诱导产生的细胞和动物模型都能较好地复现PD的症状及病理改变,出现选择性的多巴胺能神经元凋亡变性,因此被普遍用来建立环境毒素损伤的PD细胞模型和动物模型,但其具体机制一直未完全阐述清楚。Pael-R与这条凋亡途径有无关系,下调Pael-R表达能否减轻细胞凋亡目前尚未见有研究报导。为此,本研究拟以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12在神经生长因子（NGF）诱导分化后作为多巴胺能神经元替代细胞,对所得的细胞分两种方式进行处理:一方面构建RNAi表达载体,干扰该细胞内源性Parkin的表达,建立Parkin抑制的PD细胞模型;另一方面以鱼藤酮处理细胞,建立环境毒素损伤的PD细胞模型。在此基础上再构建RNAi表达载体转染两种不同的细胞模型,下调Pael-R的表达,同时分别设置未转染RNAi表达载体的空白对照组。应用RT-PCR检测各组细胞Pael-R mRNA表达、Western Blot检测细胞Pael-R蛋白表达、Hoechst 33258检测细胞凋亡、MTT检测细胞活性及流式细胞仪检测细胞凋亡比例。以此探讨在Parkin基因受抑制时和鱼藤酮毒素损伤时下调Pael-R表达对细胞凋亡的影响,为PD的神经保护治疗提供参考。本研究发现,抑制内源性Parkin基因表达后,多巴胺神经元样细胞出现了明显的凋亡现象;而若下调细胞内Pael-R基因表达后,细胞的凋亡程度则减轻。另外用鱼藤酮毒素处理细胞后,也出现了明显的凋亡;在鱼藤酮损伤的PD细胞模型中,Pael-R的mRNA及蛋白表达均无明显变化;此时再下调Pael-R基因的表达对细胞凋亡亦无明显影响,提示Pael-R可能未参与鱼藤酮诱发的多巴胺神经细胞的凋亡过程,降低Pael-R表达对鱼藤酮诱发的多巴胺神经细胞凋亡无保护作用。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、英文缩略词表
• 四、论文正文
• 前言
• 一、帕金森病研究背景
• 二、RNAi技术简介
• 三、本课题研究目的
• 第一章 Parkin基因及Pael-R基因RNAi干扰序列的筛选和载体的构建
• 1. 材料与试剂
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第二章 在Parkin基因抑制的PD细胞模型中下调Pael-R基因表达对细胞凋亡的影响
• 1. 材料与试剂
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第三章 在鱼藤酮损伤的PD细胞模型中下调Pael-R基因表达对细胞凋亡的影响
• 1. 材料与试剂
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 五、综述
• 六、致谢
• 七、攻读博士学位期间发表的文章