抗体类吸附剂的合成过程优化及性能评价

论文摘要

蛋白A免疫吸附剂已经在临床上广泛用于抗体类疾病的治疗,并取得了良好的治疗效果。但已经实现商品化的蛋白A免疫吸附柱价格昂贵,限制了其在国内的广泛使用。此外,蛋白A免疫吸附剂的保存和消毒较为苛刻,造成了使用上的不便。针对蛋白A免疫吸附剂的这两种缺陷,本论文在实验室前期工作的基础上利用自制基因工程重组蛋白A合成蛋白A免疫吸附剂,优化合成条件并对其抗体吸附性能进行评价；在搅拌条件下,对以小分子MEP为配基的抗体吸附剂MEP-Sepharose的合成过程及放大反应进行优化和考察,并对其抗体吸附性能进行评价。对蛋白A免疫吸附剂的合成,主要从合成路径、连接臂、活化密度、配基偶联量等方面进行考察,以得到单位体积吸附剂的抗体吸附量高、抗体选择性好,蛋白A偶联效率高的吸附剂为目标。研究发现,琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B经环氧氯丙烷活化后,连接己二胺和戊二醛后偶联蛋白A得到的蛋白A免疫吸附剂,其对血清中抗体的吸附效果最好,抗体吸附量可达到35 mg/mL gel以上,抗体吸附选择性好,且与进口蛋白A合成吸附剂的吸附性能相当。进一步优化活化反应过程,发现加入不同量的活化剂环氧氯丙烷可以得到不同活化密度的吸附剂,对应的抗体吸附量从8.79 mg/mL gel一直达到39.74 mg/mL gel。对蛋白A免疫吸附剂的使用效果和安全性能进行了评价。其对血清中不同类型抗体的吸附与进口蛋白A合成吸附剂的吸附规律相同,对IgG3的亲和力较弱。在对自身抗体的去除上,以对自身抗体去除率高,同时减少对其它正常抗体的去除为目标。低配基密度的蛋白A免疫吸附剂显示了对类风湿因子（RF）和抗核抗体（ANA）较好的吸附效果。配基密度为2 mg/mL的吸附剂在胶血体积比为1：2条件下对RF的去除率普遍高于40%,且个体差异小；对不同滴度的ANA吸附后,血清中ANA全部转为阴性。蛋白A免疫吸附剂展示了良好的重复使用性,重复使用10次并未导致其抗体吸附量下降,仍保持在30 mg/mL gel以上。此外,蛋白A免疫吸附剂对血浆中非抗体组分没有明显的吸附。对于MEP-Sepharose,随着配基密度的升高,MEP-Sepharose对抗体的吸附能力增强,最高达到28.53 mg/mL gel;吸附剂的耐压能力随着配基密度的升高而增强,当配基密度达到一定值后,耐压能力基本不再变化。反应体系放大100倍不会对吸附剂的配基密度和抗体吸附能力造成影响,仍保持在小试水平。MEP-Sepharose对血清中IgG3和RF的吸附能力要明显优于蛋白A免疫吸附剂,配基密度为129μmol/mL gel的MEP-Sepharose在胶血体积比为1：2条件下对IgG3的去除率可达到89.79%;配基密度为78.9μmol/mL gel的MEP-Sepharose在胶血体积比为1：2条件下对RF的去除率可达到90.32%。MEP-Sepharose对15个IgE阳性血清样本进行吸附,经过1h静态吸附后,其中11例血清中的IgE转为阴性；而蛋白A免疫吸附剂对相应的血清进行处理,只有3例转为阴性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 抗体与抗体类疾病
• 1.1.1 抗体的结构与功能
• 1.1.2 自身免疫性疾病与自身抗体
• 1.1.3 移植排斥与相关抗体
• 1.1.4 过敏性疾病与免疫球蛋白E
• 1.2 用于抗体类疾病治疗的血液净化方法
• 1.2.1 浆置换
• 1.2.2 蛋白A免疫吸附柱的临床应用
• 1.2.3 以小分子为配基的抗体吸附柱的临床应用
• 1.2.4 其它抗体吸附柱的临床应用
• 1.3 抗体吸附剂的研究进展
• 1.3.1 亲和配基吸附剂的研究
• 1.3.2 疏水电荷诱导作用基团配基吸附剂的研究
• 1.3.3 其它配基吸附剂的研究
• 2 蛋白A免疫吸附剂的合成过程优化及其抗体吸附性能研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 材料和试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 蛋白A定量检测
• 2.3.2 吸附剂合成路径
• 2.3.3 不同连接臂的吸附剂合成
• 2.3.4 环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶
• 2.3.5 不同活化密度的吸附剂合成
• 2.3.6 蛋白A免疫吸附剂对人血清抗体的吸附
• 2.3.7 亲和常数测定
• 2.3.8 吸附剂使用条件评价
• 2.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4 实验结果与讨论
• 2.4.1 蛋白A标准曲线
• 2.4.2 吸附剂合成路径的选择
• 2.4.3 不同连接臂对蛋白A偶联的影响
• 2.4.4 环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶反应的影响因素
• 2.4.5 活化密度对蛋白A偶联的影响
• 2.4.6 蛋白A偶联密度对吸附剂抗体吸附性能的影响
• 2.4.7 吸附剂对人IgG的亲和常数
• 2.4.8 与进口蛋白A合成吸附剂的抗体吸附性能比较
• 2.4.9 吸附剂的使用条件对抗体吸附选择性的影响
• 2.5 小结
• 3 蛋白A免疫吸附剂的性能评价
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 材料和试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 吸附剂对人血清中抗体及补体的吸附
• 3.3.2 吸附剂对自身抗体的吸附
• 3.3.3 重复使用效果评价
• 3.3.4 吸附剂对血浆中非抗体组分的吸附
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 人血清中抗体及补体的吸附效果
• 3.4.2 自身抗体吸附效果
• 3.4.3 重复使用性评价
• 3.4.4 血浆组分吸附
• 3.5 小结
• 4 MEP-Sepharose的合成过程的优化及放大研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 材料和试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 吸附剂合成
• 4.3.2 吸附剂对人血清中抗体的吸附
• 4.3.3 吸附剂耐压能力测定
• 4.3.4 吸附剂合成过程放大
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 MEP鉴定
• 4.4.2 影响吸附剂合成的影响因素
• 4.4.3 配基密度对吸附剂抗体吸附性能的影响
• 4.4.4 配基密度对吸附剂耐压性能的影响
• 4.4.5 吸附剂合成过程放大
• 4.5 小结
• 5 MEP-Sepharose对致病抗体的吸附性能研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 材料和试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 吸附剂对人血清中抗体及补体的吸附
• 5.3.2 吸附剂对自身抗体的吸附
• 5.3.3 吸附剂对IgE的吸附
• 5.4 实验结果与讨论
• 5.4.1 人血清中抗体及补体的吸附效果
• 5.4.2 自身抗体的吸附效果
• 5.4.3 IgE的吸附效果
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢