飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA全长的克隆与鉴定

论文摘要

用异硫氰酸胍法、CTAB法和Trizol法等三种方法提取飞机草总RNA均取得较好效果,但异硫氰酸胍法最适合本实验使用。根据菊科植物紫茎泽兰P450CYP75基因（AY954290）和拟南芥CYP75家族成员的核酸序列同源区设计引物,用RT-PCR方法首次从飞机草、泽兰、佩兰中获得大小分别为467bp、467bp、470bp的cDNA序列,分别命名为:FJC.CYP.M;ZL.CYP.M;PL.CYP.M。同源性分析表明,3个序列同源性达99%,同时与AY954290具有90%的同源性,说明它们都来自细胞色素CYP75家族。根据FJC.CYP.M核酸序列设计特异性引物,通过RACE-PCR方法克隆飞机草P450基因全长。3’RACE-PCR得到309bp cDNA序列,PolyA尾巴出现,命名为FJC.CYP.3。5’RACE-PCR得到702bp cDNA序列,命名为FJC.CYP.5。经比对发现,它与紫茎泽兰CYP75基因全长还差364bp,因此继续从紫茎泽兰CYP75基因前端设计上游引物,从FJC.CYP.5核酸序列设计下游引物,进行PCR,克隆得到一条长为384bp的cDNA序列,命名为FJC.CYP.5e。把所有飞机草细胞色素p450片段测序结果进行拼接,得到长为1653bp的cDNA序列,命名为FJC.CYP.COM,推导编码509个氨基酸,开放阅读框为31bp-1560bp,出现了3个经典的细胞色素P450氨基酸保守区域,其中一个为F××G×R×C×G,起始密码子ATG前27bp处出现了启动子序列TATAbox。功能预测表明飞机草P450蛋白为一个亲水性稳定蛋白,有内外膜共9个跨膜螺旋,定位于线粒体中。根据泽兰、佩兰中间片段设计引物,进行3’RACE-PCR,分别得到两条长为340bp、625bp的cDNA片段,分别命名为ZL.CYP.3、PL.CYP.3。经比对,初步推测ZL.CYP.3片段基因属于P450家族里某个叶绿体束缚蛋白基因,其具体的功能还有待进一步研究;PL.CYP.3片段属于P450家族的赤霉素控制蛋白基因,初步估计它参与植物激素赤霉素的合成。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 外来入侵植物
• 1.1.1 外来入侵植物概况
• 1.1.2 外来植物入侵途径及其成灾机制
• 1.1.3 外来入侵植物的危害及防治
• 1.2 飞机草
• 1.2.1 飞机草的生物特性
• 1.2.2 飞机草的分布
• 1.2.3 飞机草的危害及防治
• 1.2.4 飞机草的利用
• 1.2.5 飞机草的化感作用
• 1.2.6 飞机草的生理和分子生物学研究
• 1.3 细胞色素P450
• 1.3.1 细胞色素P450的分布和功能
• 1.3.2 植物细胞色素P450基因的克隆、鉴定与表达
• 1.4 本研究课题的目的
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 主要实验仪器
• 2.3 培养基及各种溶液的种类、组成与配制
• 2.3.1 细菌培养基
• 2.3.2 常用溶液及缓冲液
• 2.3.3 抗生素
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 引物设计
• 2.4.2 RNA提取
• 2.4.3 RNA反转录
• 2.4.4 PCR
• 2.4.5 PCR扩增产物检测
• 2.4.6 PCR产物回收纯化和胶回收
• 2.4.7 感受态制备
• 2.4.8 连接
• 2.4.9 转化
• 2.4.10 小量质粒提取
• 2.4.11 酶切验证
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA提取分析
• 3.1.1 异硫氰酸胍法提取飞机草总RNA
• 3.1.2 CTAB法提取不同植物RNA的比较
• 3.1.3 Trizol法、异硫氰酸胍法提取飞机草RNA比较
• 3.1.4 三种提取方法所获得的RNA质量分析
• 3.2 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA全长的克隆与鉴定
• 3.2.1 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA中间片段的克隆与鉴定
• 3.2.2 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA3'RACE
• 3.2.3 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA5'RACE
• 3.2.4 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA剩余5'端部分的克隆
• 3.2.5 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA全长的拼接及功能分析
• 3.3 泽兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA片段的克隆与鉴定
• 3.3.1 泽兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA中间片段克隆与鉴定
• 3.3.2 泽兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA3'RACE
• 3.4 佩兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA片段的克隆
• 3.4.1 佩兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA中间片段的克隆与鉴定
• 3.4.2 佩兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA3'RACE
• 4 讨论
• 4.1 飞机草总RNA提取方法
• 4.2 PCR优化
• 4.3 飞机草、佩兰、泽兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA中间片段的同源性
• 4.4 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA全长的克隆
• 4.5 佩兰、泽兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA片段的克隆
• 5 研究结论
• 5.1 飞机草总RNA的提取
• 5.2 飞机草、泽兰、佩兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA中间片段的克隆
• 5.3 泽兰、佩兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA3'RACE
• 5.4 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA全长的克隆
• 致谢
• 参考文献
• 附录