褶纹冠蚌cDNA文库构建与TIMP基因的表达

论文摘要

褶纹冠蚌（CristariaPlicata）是中国“淡水育珠蚌”之一,由于其易受病原体侵染而经常发病,给其育珠能力产生了较大的影响。因此对其进行分子免疫方面的研究是有必要和实际意义的。本文用Trizol法提取总RNA,依据SMART试剂盒说明方法合成cDNA,用Sfi Ⅰ酶切,将处理过的PCR产物和pBluescript Ⅱ SK载体相连接,构建褶纹冠蚌血细胞全长cDNA文库。经检测,其滴度为1.07×106cfu/mL,重组率为96%,平均插入片段为732bp。说明所构建的褶纹冠蚌血细胞文库属质量高的全长cDNA,挑500个克隆进行测序,获得297条EST,经分析,已知功能的ESTs为123个,按生物学功能把它们可以分成了七类。对碱基为821bp的EST片段,进行比对分析后,认为它是褶纹冠蚌TIMP基因,经测定发现它在闭壳肌中表达最大,而在血细胞、外套膜、肝胰腺和性腺中表达量则低得多。注射嗜水气单胞菌6,12,24,48h后,经荧光定量分析测定,其在血细胞,肝胰腺,鳃表达水平均有一定量的升高。设计含酶切位点的表达引物,从褶纹冠蚌的血液中提取总RNA,利用RT-PCR法扩增出TIMP基因,经基因序列分析后构建表达载体PET-30a（+）-TIMP,转化大肠杆菌BL21,再经过IPTG诱导TIMP表达,利用SDS-PAGE分析表达产物。最后利用N2+-NTA将其融合蛋白纯化出来。结果表明重组的TIMP在大肠杆菌（Escherichia coli）37℃下诱导均以包涵体形式存在,大小为32KDa左右；其N端表达产物为20KDa左右。优化表达条件后,加1mM IPTG,15℃下诱导34h,其N端表达产物有可溶性蛋白存在,并可以纯化出来。即可通过基因克隆和原核表达的方式可以获得具有生物活性的TMP融合蛋白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 目录
• 第一章 金属蛋白酶组织抑制因子研究进展
• 1.1 前言
• 1.2 TIMP结构与分类
• 1.3 TIMP生物学功能
• 1.4 其他脊椎动物的TIMP
• 1.5 无脊椎动物TIMP
• 1.6 cDNA文库的构建与EST分析技术
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 褶纹冠蚌血细胞cDNA文库的构建及EST序列的分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2. 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 载体和菌株
• 2.2 方法
• 2.2.1 样品总RNA的抽提
• 2.2.2 mRNA纯化
• 2.2.3 cDNA合成、酶切及分级分离
• *载体的连接'>2.2.4 cDNA与pBluescript Ⅱ SK^*载体的连接
• 2.2.5 重组质粒的转化
• 2.2.6 文库滴度及质量检测
• 2.2.7 cDNA文库的筛选与测序
• 2.2.8 EST测序结果分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 总RNA的提取
• 2.3.2 cDNA合成、酶切及分级分离
• 2.3.3 文库的滴度及库容
• 2.3.4 EST的测序及结果分析
• 2.4. 讨论
• 第三章 褶纹冠蚌TIMP基因的克隆与表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 主要仪器设备见第二章
• 3.1.3 试剂和菌株见第二章
• 3.2 方法
• 3.2.1 总RNA提取
• 3.2.2 第一链cDNA的合成
• 3.2.3 3’RACE的扩增
• 3.2.4 序列分析及系统进化树的构建
• 3.2.5 荧光定量分析TIMP基因的组织分布
• 3.2.6 嗜水气单胞菌刺激后TIMP基因的表达变化
• 3.2.7 TIMP基因的原核表达
• 3.2.8 重组cpTIMP和N-TIMP的诱导表达及表达条件的优化
• 3.2.9 重组表达蛋白的纯化
• 3.3 结果
• 3.3.1 褶纹冠蚌血细胞中总RNA的纯度
• 3.3.2 Cp-T-P的cDNA序列及推导的氨基酸序列特征
• 3.3.3 多重序列比较和进化树分析
• 3.3.4 TIMP的组织分布
• 3.3.5 细菌刺激后TIMP在褶纹冠蚌血细胞、肝胰腺和鳃组织中的表达变化
• 3.3.6 TIMP的原核表达与纯化
• 3.3.6.1 cpTIMP和cp-N-TIMP重组质粒的构建
• 3.3.6.2 cpTIMP和cp-N-TIMP重组蛋白的诱导和纯化
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果