杏鲍菇胞壁β-葡聚糖的分离纯化、结构分析及生物活性研究

论文摘要

杏鲍菇[Pleurotus eryngii（D C.:Fr Quel）],又名刺芹侧耳,是一种在我国很有发展前景的集食用、药用和食疗于一体的新型珍稀食用真菌,其营养成分丰富,富含碳水化合物、蛋白质、维生素、多种矿物质等。同时,杏鲍菇多糖含量也很丰富。已有研究证明杏鲍菇多糖能降低机体胆固醇含量、防止动脉硬化、增强机体免疫机能、促进胃肠消化、防止心血管病、抵抗病毒等功效。多糖分布于胞内、胞外和胞壁上,种类繁多,功能不一。多糖的分子量、单糖组成及结构与其功能活性具有明显的相关性。作为占真菌细胞干重20%的细胞壁,含有丰富的β-葡聚糖,且β-葡聚糖具有良好的生物活性,但是未见有从杏鲍菇细胞壁提取β-葡聚糖的报道。因此,本文以杏鲍菇子实体为原料,研究杏鲍菇胞壁β-葡聚糖的提取、分离纯化、理化性质、化学结构和生物活性,旨在为杏鲍菇胞壁β-葡聚糖的产业化开发提供理论基础,同时丰富食用菌多糖结构数据库资料。主要结论如下:（1）杏鲍菇子实体经碱提醇沉得到胞壁粗多糖的产率为9.6%,即每100 g的杏鲍菇子实体干粉可以提取9.6 g胞壁粗多糖;测得该胞壁粗多糖的糖含量为84.6%。杏鲍菇胞壁粗多糖经羧甲基纤维素（CMC）离子交换柱、Sephadex G-75凝胶柱分离纯化得到一色谱纯多糖（PEWP）。采用高效液相色谱、红外光谱及化学分析等方法对PEWP的纯度、分子量及基本结构进行研究。结果表明:PEWP分子量为41 kDa,糖基组成为葡萄糖;红外光谱分析表明,PEWP具有多糖的特征吸收峰和典型的β-糖苷键构型;高碘酸氧化及Smith降解分析表明,PEWP中1→4糖苷键残基比例为83.3%,1→6糖苷键残基比例为12.8%,1→3糖苷键残基比例为2.4%,1→2糖苷键残基比例为1.5%。（2）纯化后的杏鲍菇胞壁β-葡聚糖为白色云母状固体,无味,易溶于水,易吸潮,不溶于高浓度的乙醇、甲醇等极性溶剂。苯酚-硫酸法测定其糖含量为98.58%。其1%水溶液的pH为6.54,3%水溶液在610 nm下的透光率为63.92%,水溶液的比旋度[a]D10为223.52,10%水溶液的粘度为2.14 mPa-s。（3）以含有不同浓度杏鲍菇胞壁β-葡聚糖的培养液培养人胃黏膜上皮细胞,测定其增殖率和迁移率,并以倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。结果表明:低浓度（0.08 mg/mL、0.4 mg/mL、2 mg/mL）PEWP能促进人体外胃黏膜上皮细胞的增殖和迁移,加速损伤区域上皮细胞的生长,具有保护胃黏膜的作用。其中以0.4 mg/mL PEWP促人胃黏膜上皮细胞增殖和迁移的效果最好。（4）研究杏鲍菇胞壁β-葡聚糖对大鼠高脂膳食诱导肥胖和高脂血症的预防效果。结果表明:杏鲍菇胞壁β-葡聚糖可以抑制饲喂高脂饲料大鼠体重的增长,控制大鼠体内脂肪的堆积,降低大鼠肝脏和心脏脂肪沉淀,减轻脂肪肝的发生;同时降低大鼠血清的TC、TG水平,提高HDL-C的水平,降低动脉粥样硬化发生的几率;降低大鼠肝脏SOD活性和MDA水平,改善大鼠体内的氧化应激程度。因此认为,杏鲍菇胞壁β-葡聚糖具有预防肥胖症、高脂血症以及抗动脉粥样硬化的潜在作用。（5）研究杏鲍菇胞壁β-葡聚糖对高脂膳食诱导大鼠肥胖和高脂血症的治疗效果。结果表明:杏鲍菇胞壁β-葡聚糖能抑制饲喂高脂饲料大鼠体重的增长,改善其血清和肝脏脂质指标的质量,起到减肥降脂作用。（6）研究杏鲍菇胞壁β-葡聚糖（PEWP）和杏鲍菇子实体胞外多糖（PEP）对兔子离体小肠α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果。结果表明:杏鲍菇胞壁β-葡聚糖（PEWP）对兔子离体小肠α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用不明显,而杏鲍菇子实体胞外多糖（PEP）的抑制效果显著。因此认为,杏鲍菇多糖降血糖的关键生物活性成分是胞外多糖。

论文目录

• 缩略词一览表
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述和选题依据
• 1.1 杏鲍菇概述
• 1.1.1 杏鲍菇的营养价值
• 1.1.2 杏鲍菇的生物活性
• 1.2 杏鲍菇多糖的研究进展
• 1.2.1 杏鲍菇多糖的提取分离
• 1.2.1.1 传统提取法
• 1.2.1.2 酶法提取
• 1.2.1.3 超声波辅助提取
• 1.2.1.4 微波辅助提取
• 1.2.2 杏鲍菇多糖的生物活性
• 1.2.2.1 抗氧化
• 1.2.2.2 增强免疫力
• 1.2.2.3 降血脂
• 1.2.2.4 抗肿瘤
• 1.2.2.5 抗疲劳
• 1.2.2.6 抑制血管再生
• 1.3 β-葡聚糖的研究进展
• 1.3.1 β-葡聚糖的命名
• 1.3.2 β-葡聚糖的自然来源
• 1.3.3 β-葡聚糖化学
• 1.3.4 β-葡聚糖的生物活性
• 1.3.4.1 增强免疫力
• 1.3.4.2 减肥降脂
• 1.3.4.3 降血糖
• 1.3.4.4 抗肿瘤
• 1.3.4.5 抗氧化
• 1.3.4.6 抗炎
• 1.3.4.7 抗疲劳
• 1.3.5 β-葡聚糖的吸收
• 1.3.6 β-葡聚糖的生物活性与结构的关系
• 1.3.6.1 分支度与活性的关系
• 1.3.6.2 分子量与活性的关系
• 1.3.6.3 连接方式及特定基团与活性的关系
• 1.3.7 β-葡聚糖的食用安全性
• 1.4 本研究的选题依据及主要内容
• 1.4.1 研究的选题依据
• 1.4.2 主要研究内容
• 第二章 杏鲍菇胞壁β-葡聚糖的提取、分离纯化、理化性质和结构分析
• 2.1 实验仪器、试剂和材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 试验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 多糖含量测定
• 2.2.1.1 标准曲线的绘制
• 2.2.1.2 样品多糖含量的测定
• 2.2.2 离子交换柱层析
• 2.2.2.1 材料预处理
• 2.2.2.2 离子交换柱层析
• 2.2.3 凝胶柱层析
• 2.2.4 理化性质测定
• 2.2.4.1 多糖的性状
• 2.2.4.2 pH值测定
• 2.2.4.3 粘度的测定
• 2.2.5 纯度测定
• 2.2.5.1 比旋度法
• 2.2.5.2 HPLC法
• 2.2.6 旋光度测定
• 2.2.7 分子量测定
• 2.2.8 单糖组成分析
• 2.2.8.1 样品的制备及糖腈乙酰化
• 2.2.8.2 气相色谱分析条件
• 2.2.9 紫外光谱分析
• 2.2.10 红外光谱分析
• 2.2.11 糖苷键分析
• 2.2.11.1 高碘酸氧化
• 2.2.11.2 Smith降解
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 杏鲍菇胞壁β-葡聚糖的提取
• 2.3.2 杏鲍菇胞壁β-葡聚糖的分离纯化
• 2.3.3 PEWP的理化特性
• 2.3.4 PEWP的纯度鉴定
• 2.3.4.1 比旋度法
• 2.3.4.2 HPLC法
• 2.3.5 PEWP分子量的测定
• 2.3.6 PEWP的单糖组成分析
• 2.3.7 PEWP的紫外-可见光谱分析
• 2.3.8 PEWP糖链结构分析
• 2.3.8.1 PEWP糖苷键键型分析
• 2.3.8.2 PEWP糖苷键连接方式分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 杏鲍菇胞壁β-葡聚糖促人胃粘膜上皮细胞增殖和迁移效果研究
• 3.1 实验仪器、试剂和材料
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 试验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 多糖溶液制备
• 3.2.2 细胞培养
• 3.2.3 PEWP对人胃粘膜上皮细胞GES-1增殖的影响
• 3.2.4 PEWP对人胃粘膜上皮细胞GES-1迁移的影响
• 3.2.5 数据处理
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 PEWP对GES-1细胞增殖的影响
• 3.3.2 PEWP对GES-1细胞迁移的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 杏鲍菇胞壁β-葡聚糖对大鼠高脂膳食诱导肥胖及高脂血症的预防作用研究
• 4.1 实验仪器、试剂和材料
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 试验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 动物饲养及造模
• 4.2.2 动物取样
• 4.2.3 血脂测定
• 4.2.4 肝脏中抗氧化水平测定
• 4.2.4.1 SOD活性的测定
• 4.2.4.2 丙二醛（MDA）含量的测定
• 4.2.4.3 蛋白质含量测定
• 4.2.5 组织病理学
• 4.2.6 数据处理
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 PEWP对大鼠体重、增重和摄食量的影响
• 4.3.2 PEWP对大鼠体内脂肪和脂肪系数的影响
• 4.3.3 PEWP对大鼠各脏器指数的影响
• 4.3.4 PEWP对大鼠血脂、肝功能及动脉粥样硬化指数的影响
• 4.3.4.1 PEWP对大鼠血清脂质水平及动脉粥样硬化指数的影响
• 4.3.4.2 PEWP对大鼠肝功能的影响
• 4.3.5 PEWP对大鼠肝脏及心脏主动脉组织病理学的影响
• 4.3.5.1 肝脏解剖观察
• 4.3.5.2 肝脏病理学观察
• 4.3.5.3 心脏主动脉病理学观察
• 4.3.6 PEWP对大鼠肝脏抗氧化水平的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 杏鲍菇胞壁β-葡聚糖对高脂膳食诱导大鼠肥胖及高脂血症的治疗作用研究
• 5.1 实验仪器、试剂和材料
• 5.1.1 实验仪器
• 5.1.2 实验试剂
• 5.1.3 试验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 动物饲养及造模
• 5.2.2 动物取样
• 5.2.3 血脂测定
• 5.2.4 肝脏中抗氧化水平测定
• 5.2.5 肝脏中脂蛋白脂酶（LPL）和肝脂酶（HL）活性测定
• 5.2.6 组织病理学
• 5.2.7 数据处理
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 高脂饲料对大鼠造模结果分析
• 5.3.2 PEWP对大鼠体重、增重和摄食量的影响
• 5.3.3 PEWP对大鼠体脂、脂肪系数的影响
• 5.3.4 PEWP对大鼠各脏器指数的影响
• 5.3.5 PEWP对大鼠血脂、肝功能及动脉粥样硬化指数的影响
• 5.3.5.1 PEWP对大鼠血清脂质水平及动脉粥样硬化指数的影响
• 5.3.5.2 PEWP对大鼠肝功能的影响
• 5.3.6 PEWP对大鼠肝脏及心脏主动脉组织病理学的影响
• 5.3.6.1 肝脏解剖观察
• 5.3.6.2 肝脏病理学观察
• 5.3.6.3 心脏主动脉病理学观察
• 5.3.7 PEWP对大鼠肝脏抗氧化水平的影响
• 5.3.8 PEWP对肝脏中肝脂酶和脂蛋白脂酶活性的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 杏鲍菇胞壁β-葡聚糖对小肠α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究
• 6.1 实验仪器、试剂和材料
• 6.1.1 实验仪器
• 6.1.2 实验试剂
• 6.1.3 试验材料
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 杏鲍菇多糖的制备
• 6.2.1.1 杏鲍菇胞外多糖（PEP）制备
• 6.2.1.2 杏鲍菇胞壁β-葡聚糖（PEWP）的制备
• 6.2.2 兔子离体小肠α-葡萄糖苷酶的制备
• 6.2.3 多糖及拜糖平对兔子离体小肠α-葡萄糖苷酶活性抑制效果的测定
• 6.2.4 α-葡萄糖苷酶活性抑制结果的计算
• 6.2.5 数据处理
• 6.3 结果与分析
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 全文总结与展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 主要创新点
• 7.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的的论文