NIRF泛素化p53作用过程中NIRF与p53结合域的测定

论文摘要

目的Np95/ICBP90-like RING finger protein（NIRF）是新近发现的一种核蛋白，其包括802个氨基酸残基，蛋白分子内部含有UBL（ubiquitin-like domain）、PHD、YDG/SRA和RING finger结构域。随着其研究的深入，NIRF功能已涉及细胞增殖调节、蛋白多聚泛素化降解、细胞癌变进程控制以及更多未知的领域。已有研究报道，NIRF能与Cdk2-cyclin E复合体和let-7a结合，过表达的NIRF能阻止细胞周期于G1期。另外NIRF还具有泛素化酶E3的作用，即泛素化和自我泛素化功能，表明NIRF介导重要的蛋白降解途径。p53是细胞内重要的抑癌基因，p53的功能活动被认为是细胞对细胞异常、损伤、压力的一种应激反应，通过启动自我修复程序抑制细胞分裂诱导其进入衰老程序，或启动细胞程序性死亡清除异变的细胞。已有研究报道NIRF能与p53相互作用, NIRF本身也是一个高度调节蛋白，在细胞正常的生理状态下发挥泛素化E3连接酶的作用结合p53并将其降解，但NIRF与p53结合的蛋白结合域目前尚不清楚。本文研究证明NIRF能与p53结合成复合体参与泛素化蛋白降解途径，并测定出NIRF与p53结合的区域，为下一步研究蛋白泛素化降解和肿瘤的治疗提供实验基础和依据。方法（1）采用DMEM培养基培养HEK293细胞。培养基中补充含10%小牛血清和双抗。（2） RIPA蛋白裂解液收集HEK293细胞总蛋白。（3）细胞转染按照转染试剂说明说进行，转染48小时之后收获细胞，细胞收获前10小时添加蛋白酶体抑制剂MG-132。（4）将NIRF突变体在细胞内全部表达。在HEK293细胞内，分别转染四个突变体质粒，同时转染pCMV-3×FLAG空质粒和pCMV-FLAG-NIRF全长质粒，作为阴阳性对照．细胞裂解液经Western印迹，anti-NIRF, anti-FLAG和anti-β-Actin抗体检测分析。（5）用免疫蛋白共沉淀技术和蛋白质印迹分析技术鉴定NIRF与p53结合的蛋白结合域。HEK293细胞分别同时转染p53和各突变体质粒，细胞裂解液经p53抗体IP纯化，产物经WB分析。NIRF全长能与p53稳定结合，同时转染NIRF全长质粒作为阳性对照。结果结果显示，所有的突变体都能在细胞中表达，并且两种抗体检测结果完全一致。在免疫共沉淀试验中，ΔUBL、ΔYDG/SRA和ΔRING缺失突变体蛋白依然能被p53沉淀出，而ΔPHD却未能被p53沉淀出。结论本研究表明，NIRF通过PHD区域与p53形成复合体.该复合体可能参与蛋白分选、蛋白降解、DNA修复以及细胞凋亡等一系列重要的细胞活动，从而形成与细胞增殖相关的新的信号通路，在肿瘤的发生发展中可能发挥着某种程度上作用。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附图
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间已发表的文章