正肝化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织胶原蛋白及TNFR介导的信号转导通路的影响

论文摘要

目的:采用CCL4复合因素诱导大鼠肝纤维化模型,观察正肝化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织SOD、GSH、MDA和Hyp、α-SMA、Ⅰ型、Ⅳ型胶原的影响,探讨其对肝组织脂质过氧化和胶原蛋白的作用;观察正肝化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织MMP-2/9、TIMP-1/2蛋白表达的影响,探讨其对ECM合成和降解的作用;观察正肝化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织TNF-αmRNA、TNF-α、TNFR、P-IκB、NF-κB等蛋白表达的影响,探讨其对TNFR介导的TNF-α/NF-κB的信号转导通路和肝星状细胞凋亡的干预作用。从不同层面研究正肝化瘀方延缓、阻断和逆转肝纤维化的作用及机制,为中医药防治肝纤维化提供新思路和实验依据。方法:1.肝纤维化大鼠模型的制备:SD大鼠48只,随机分为正常组、模型组、正肝化瘀方组（治疗组）、复方鳖甲软肝片组（阳性对照组）,每组均为12只。采用CCL4复合因素造模方法,除正常组外,其余各组大鼠首剂均按5ml/kg体重剂量颈后皮下注射40%CCl4橄榄油溶液,以后每周3次按3ml/kg体重颈后皮下注射40%CCl4橄榄油溶液,连用6周。除正常组外,各组前2周以高脂低蛋白饲料喂养,2周后以纯玉米粉饲料喂养;正常组同时以等量生理盐水颈后皮下注射,以普通饲料喂养。正肝化瘀方组按17g/kg大鼠体重的正肝化瘀方灌胃,复方鳖甲软肝片组按25g/kg大鼠体重的剂量灌予复方鳖甲软肝片,模型组、正常组同时以等量生理盐水灌胃。在造模当天开始,每日1次,连用6周。2.样品采集与处理:第6周末,各组大鼠用2%戊巴比妥钠以2ml/kg体重剂量腹腔注射麻醉,开腹观察肝脏的大体情况。经下腔静脉采血,摘取肝、脾,称重后,于肝脏左叶取肝组织2块,投入液氮中用于抽提RNA测定;取1 mm3肝组织用2%戊二醛和1%锇酸溶液双固定,送电镜室观察。另切取肝组织2块,10%中性福尔马林固定,24h后逐级酒精脱水,二甲苯透明,包埋、切片,用于HE、天狼星红染色;其余肝组织切碎后放入1.5ml离心管中投进液氮缸速冻,-70℃保存备用。3.主要观测指标和方法:实验中每天观察大鼠一般情况并称重,实验结束后计算大鼠肝指数、脾指数,观察大鼠肝脏外形、体积、颜色、质地改变情况,肝组织切片HE染色光镜观察肝组织炎症病理,天狼星红染色观察肝组织胶原沉积,透射电镜观察肝组织超微病理和胶原纤维,比色法检测肝组织SOD、GSH活力和MDA含量,Jamall氏法检测肝组织Hyp含量,Western blot法分析肝组织α-SMA与Ⅰ型、Ⅳ型胶原的蛋白表达,明胶酶图法检测肝组织MMP-2、MMP-9活性,Western blot法分析肝组织MMP-2、MMP-9与TIMP-1、TIMP-2的蛋白表达,RT-PCR法检测肝组织TNF-αmRNA基因表达,Western blot法分析肝组织TNF-α、TNFR和P-IκB的蛋白表达,EMSA法检测肝组织NF-κB蛋白的活性。结果:1.成功复制大鼠肝纤维化模型。模型组肝纤维化形成明显,肝小叶结构破坏,肝组织中胶原纤维含量和沉积明显增加,电镜观察显示模型组大鼠肝细胞线粒体等细胞器的损伤明显,Disse间隙的胶原蛋白显著增多。正肝化瘀方组和复方鳖甲软肝片组肝小叶结构基本存在,Disse间隙的胶原蛋白比模型组显著减少。脂质过氧化检测显示,模型组SOD、GSH活力明显下降,MDA含量明显增加,正肝化瘀方组和复方鳖甲软肝片组SOD、GSH活力较模型组有明显提高,MDA含量有所下降低。模型组大鼠肝组织Hyp含量较正常组显著升高,正肝化瘀方组和复方鳖甲软肝片组大鼠肝组织Hyp含量较模型组显著降低,以正肝化瘀方组降低更为明显。模型组大鼠肝组织α-SMA蛋白表达明显增强,正肝化瘀方组和复方鳖甲软肝片组α-SMA蛋白表达明显减弱。模型组肝组织Ⅰ/Ⅳ型胶原蛋白表达显著增强,正肝化瘀方组和复方鳖甲软肝片组Ⅰ/Ⅳ型胶原蛋白表达均有减弱,正肝化瘀方组Ⅰ型胶原蛋白表达下调更为明显。2.明胶酶图法显示正常组大鼠肝组织MMP-2/9蛋白活性较低,而模型组大鼠肝组织MMP-2/9活性显著升高,尤其是Action MMP-2升高更明显;正肝化瘀方组与复方鳖甲软肝片组大鼠肝组织MMP-2/9活性较正常组均有升高,但与模型组比较,两用药组的MMP-2/9蛋白活性明显下降;正肝化瘀方组MMP-9活性下降较复方鳖甲软肝片组明显。Western blot结果显示,正常组大鼠肝组织MMP-2/9蛋白表达极低,TIMP-1/2蛋白少量表达;模型组大鼠肝组织MMP-2/9蛋白表达明显增强,TIMP-1/2蛋白表达也显著增强;正肝化瘀方组与复方鳖甲软肝片组大鼠肝组织MMP-2/9蛋白和TIMP-1/2蛋白表达均较模型组减弱,以正肝化瘀方组下调MMP-9和TIMP-2蛋白表达更为明显。3.RT-PCR法结果显示,正常组大鼠肝组织TNF-αmRNA基因有较低水平的表达,而模型组大鼠肝组织TNF-αmRNA表达显著增强,正肝化瘀方组与复方鳖甲软肝片组大鼠肝组织TNF-αmRNA表达较正常组均有升高,与模型组比较,正肝化瘀方组大鼠肝组织TNF-αmRNA的表达明显减弱。Western blot结果显示,正常组大鼠肝组织有TNF-α、TNFR蛋白表达,P-IκB表达不明显,模型组大鼠肝组织TNF-α、TNFR、P-IκB蛋白表达明显增强;正肝化瘀方组与复方鳖甲软肝片组大鼠肝组织TNF-α、TNFR蛋白表达均较模型组减弱,P-IκB蛋白表达有所减弱,以正肝化瘀方组下调TNFR、P-IκB蛋白表达更为明显;EMSA法分析显示,正常组大鼠肝组织NF-κB的活性很低,模型组大鼠肝组织NF-κB的活性显著升高,正肝化瘀方组和复方鳖甲软肝片组NF-κB活性比正常组有明显升高,但比模型组有所下降,正肝化瘀方组显著降低肝组织NF-κB活性。结论:1.正肝化瘀方能减轻肝细胞炎症和线粒体损伤,抑制肝内纤维增生和沉积;显著提高CCL4诱导的肝纤维化大鼠肝组织SOD和GSH的活力,降低MDA含量;降低肝组织Hyp含量;下调α-SMA蛋白表达和减少肝组织中Ⅰ型、Ⅳ型胶原的沉积。正肝化瘀方有保护肝细胞、抗脂质过氧化、减轻肝细胞损害及其脂肪变性、减少胶原生成和沉积的作用,其抗肝纤维化机制与通过脂质过氧化作用促进自由基清除,抑制HSC活化和成纤维细胞的增殖,减少胶原合成与沉积有关。2.正肝化瘀方能显著降低大鼠肝组织MMP-2/9蛋白活性,下调肝组织MMP-2/9蛋白和TIMP-1/2蛋白的表达,解除TIMPs对MMPs降解ECM酶活性的抑制作用,促进ECM的降解,抑制肝纤维化的形成,促进肝纤维化的逆转。3.正肝化瘀方可明显抑制纤维化大鼠肝组织TNF-αmRNA基因的表达,显著下调大鼠肝组织TNF-α、TNFR蛋白表达,明显抑制P-IκB的磷酸化水平及NF-κB的活性,其抗肝纤维化作用与抑制参与肝纤维化启动与进展的TNF-α及其受体的表达,抑制P-IκB蛋白表达与NF-κB的活性,干预TNFR介导的TNF-α/NF-κB信号转导通路,阻断TNF-α与NF-κB形成的恶性循环,从而减轻肝脏炎症损伤,促进HSC的凋亡,达到延缓、阻断和逆转肝纤维化有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 前言
• 第一章 正肝化瘀方对纤维化大鼠肝组织脂质过氧化和胶原蛋白的影响
• 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要药物
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 分组
• 2.2 模型制备与处理
• 2.3 样品采集与处理
• 2.4 一般情况观察
• 2.5 大鼠肝组织脂质过氧化检测
• 2.6 大鼠肝组织羟脯氨酸含量测定
• 2.7 肝组织α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原蛋白表达
• 2.8 大鼠肝组织病理学观察
• 2.9 大鼠肝细胞超微结构的观察
• 3 统计学处理
• 结果
• 1 各组大鼠一般情况与体重、肝体比、脾体比的变化
• 2 各组大鼠肝组织病理学变化
• 3 各组大鼠肝组织SOD、GSH、MDA的变化
• 4 各组大鼠肝组织Hyp含量变化
• 5 各组大鼠肝组织α-SMA蛋白表达变化
• 6 各组大鼠肝组织Ⅰ型、Ⅳ型胶原蛋白表达的变化
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 正肝化瘀方对纤维化大鼠肝组织MMPs和TIMPs蛋白表达的影响
• 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要药物
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 分组
• 2.2 模型制备与处理
• 2.3 观测样品的采集与处理
• 2.4 肝组织MMP-2、MMP-9活性测定
• 2.5 肝组织MMP-2、MMP-9蛋白表达
• 2.6 肝组织TIMP-1、TIMP-2蛋白表达
• 3 统计学处理
• 结果
• 1 各组大鼠肝组织MMP-2、MMP-9活性的变化
• 2 各组大鼠肝组织MMP-2、MMP-9蛋白表达的变化
• 3 各组大鼠肝组织TIMP-1、TIMP-2蛋白表达的变化
• 讨论
• 参考文献
• 第三章 正肝化瘀方对纤维化大鼠肝组织TNFR介导的信号转导通路的影响
• 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要药物
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 分组
• 2.2 模型制备与处理
• 2.3 样品的采集与处理
• 2.4 肝组织TNF-α mRNA基因表达
• 2.5 肝组织TNF-α、TNFR、P-IκB蛋白表达
• 2.6 肝组织NF-κB活性测定
• 3 统计学处理
• 结果
• 1 各组大鼠肝组织TNF-α mRNA基因表达的变化
• 2 各组大鼠肝组织TNF-α、TNFR蛋白表达的变化
• 3 各组大鼠肝组织P-IκB蛋白表达的变化
• 4 各组大鼠肝组织NF-κB活性的变化
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 创新点
• 综述:肝纤维化发生的分子机制研究进展
• 致谢
• 附录一 参加会议和发表的论文
• 附录二 实验常用技术