中慢生型百脉根根瘤菌群体感应系统的特性研究及对其共生结瘤的影响

论文摘要

群体感应是细菌通过可扩散的小分子量自体诱导物信号分子来感知细胞群体密度的变化,从而进行基因表达调控的生理行为。根瘤菌能够侵入豆科植物根部形成根瘤和固氮,此共生关系的形成是一个复杂的信号交流过程。目前,已经在许多根瘤菌中发现群体感应系统在结瘤固氮过程中起重要的调节作用,如调控结瘤效率,生物膜的形成,胞外多糖的产生和固氮效率等。百脉根根瘤菌作为中慢生型根瘤菌的模式菌株,研究其群体感应系统在结瘤固氮中的作用,对于深入了解微生物与植物之间的共生关系及生产应用都具有很大的意义。通过对百脉根根瘤菌M.loti MAFF303099全基因组序列同源比对发现,该菌中至少含有4种与luxI家族同源的AHL类自体诱导物合成酶基因,分别为mlr5638、mlr6103、mlr6385和mlr9546。本实验中应用高效检测菌株JZA1对百脉根根瘤菌NZP 2213的培养上清液进行了检测,发现有AHL分子的存在,并且AHL的产生活性具有典型的依赖细胞密度的特点,即在低细胞密度时产生较低的AHL活性,高细胞密度时产生较高的AHL活性,随后由于菌体PH值升高导致碱水解和酶的降解使AHL的活性降低,说明百脉根根瘤菌中存在群体感应系统。利用乙酸乙酯对培养上清液抽提后,TLC分析显示至少存在有4种AHLs分子,由电喷雾电离质谱（ESI-MS/MS）分析推测4种AHLs分子分别是3-Oxohexanoyl-homoserine lactone（3-O-C6-HSL,MW214）,Octanoyl-HSL（C8-HSL,MW 228）,decanoyl-HSL（C10-HSL,MW 256）和docecanoyl-HSL（C12:1-HSL,MW 282）。根据百脉根根瘤菌MAFF303099全基因组序列,利用PCR扩增技术,成功得到了3个自体诱导物合成酶基因,分别命名为mrlI1、mrlI2,mrlI3,它们分别对应于基因组上的mlr5638、mlr6385和mlr6103。为了研究mrlI2,3对于自体诱导物的合成情况,将mrlI2、mrlI3分别在具有Ptac启动子的质粒pYC12上表达,结果在mrlI2表达的Ecoli培养上清液中发现了3种短链AHLs分子,而mrlI3却没有发现AHLs活性。为了进一步确认它们的功能,分别构建了mrlI2、mrlI3.mrlI2、mrlI1,3,mrlI2,3和mrlI1-3的缺失菌株,通过对六种缺失突变菌株培养上清液的AHLs分子进行TLC分析表明,mrlI2负责合成3种短链AHLs,而mrlI3不合成任何的AHLs。为了进一步研究自体诱导物合成酶基因mrlI2和mrlI3的表达情况,在广宿主质粒pRA301上分别构建了PmrlI-lacZ融合表达质粒,将其分别转化到大肠杆菌和百脉根野生型菌株中,结果表明基因mrlI2很低量表达,而mrlI3几乎不表达,推测mrlI2是组成型表达的,mrlI3只有在共生过程中诱导因子存在的条件下才表达,可能在共生过程中起着作用。在生理实验中,通过对各mrlI突变株的研究,表明群体感应系统对菌体本身的生长速度没有什么影响,同时也不影响菌体胞外多糖的形成。在结瘤实验中,与百脉根根瘤菌野生型菌株相比,各mrlI突变菌株在宿主上的结瘤数量都呈现出不同程度的降低,这些数据表明百脉根根瘤菌的群体感应系统在与宿主的共生结瘤过程中起着重要的调节作用,但确切的调控机制目前还不太清楚。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 一 群体感应及其研究进展
• 二 根瘤菌中的群体感应及其研究进展
• 三 群体感应研究技术与方法
• 参考文献
• 第一章 M.loti NZP2213自体诱导物的检测和鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 参考文献
• 第二章 M.loti NZP2213自体诱导物合成酶基因的特性研究
• 第一节 mrlI基因的克隆及表达
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 第二节 mrlI基因敲除菌株的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 第三节 群体感应系统中mrlI基因的表达及调控
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 参考文献
• 第三章 M.loti NZP2213自体诱导物合成酶基因生理功能的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢