高温胁迫条件下紫花苜蓿抑制消减cDNA文库的构建与初步分析

论文摘要

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是在世界范围内栽培历史最悠久、面积最广泛的豆科牧草,堪称“牧草之王”。紫花苜蓿具有产草量高、富含蛋白质、生物固氮能力强和适应性广的特性,对我国畜牧业的发展、粮食食品安全等具有重大作用。随着人类活动的增加,全球气温逐年上升,高温热害变得非常突出,致使紫花苜蓿植株生长缓慢、枯萎甚至死亡,病虫害增多,严重抑制紫花苜蓿的生长发育,影响紫花苜蓿的产量和品质。目前在高温对紫花苜蓿的研究主要集中在高温对紫花苜蓿的影响、紫花苜蓿适应高温胁迫的机制及其耐热性评价指标的选择和可靠性评价的方法等方面,而针对在分子水平寻找紫花苜蓿耐热基因的研究还很少报导。抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）是由Diatchenko等于1996年以mRNA差异显示技术为基础建立起来的筛选未知差异基因的新技术。采用该技术能够在较短时间内获得差异表达基因的cDNA片段,可有效富集稀有基因序列1000倍以上,使某些低丰度表达的mRNA有望被检出。为分离和获得紫花苜蓿高温胁迫诱导相关基因片段的EST序列。本试验以标准秋眠级为6级的紫花苜蓿（ABI 700）为材料,以45℃高温胁迫下的紫花苜蓿幼嫩茎叶cDNA为tester,以正常生长（22℃）的紫花苜蓿幼嫩茎叶cDNA为driver,利用SSH构建了高温胁迫下紫花苜蓿幼嫩茎叶的正向抑制消减文库。从消减文库中随机挑取120个阳性克隆,进行菌液PCR鉴定。结果显示,消减文库的滴度为4230pfu/ml,重组率为97.8%,插入片段大小主要集中在300-750bp之间。从消减cDNA文库中随机挑取120个白斑,经菌落PCR筛选得到117个差异表达的克隆。测序后得到111个质量合格的EST序列,经相同片段合并、电子克隆得到有效EST序列48个。根据在GenBank非冗余核酸数据库（nr）和EST数据库中BLASTn序列比对结果,将这些EST分为3类:第一类代表已知基因共19个;第二类代表已知EST共8个;第三类为新EST共21个。代表已知基因的ESTs按照基因功能分为七类:信号转导、细胞生长/凋亡、抗逆/机体防御、物质转运、转录调控、代谢及功能待定等。本研究为紫花苜蓿抗热基因克隆和系统研究高温胁迫下紫花苜蓿基因的表达奠定了一定的理论基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 缩略词
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 苜蓿的特征特性
• 1.2 夏季高温对紫花苜蓿的影响
• 1.2.1 高温对紫花苜蓿生长发育的影响
• 1.2.2 高温对紫花苜蓿越夏性能的影响
• 1.2.3 高温对苜蓿病虫危害的影响
• 1.2.4 高温对苜蓿草产量和质量的影响
• 1.3 紫花苜蓿适应高温胁迫的机理
• 1.3.1 渗透调节作用
• 1.3.2 过氧化作用
• 1.3.3 高温诱导蛋白
• 1.3.4 光合作用
• 1.3.5 呼吸作用
• 1.4 紫花苜蓿的抗热性评价
• 1.5 紫花苜蓿秋眠性及抗热性的关系
• 1.5.1 紫花苜蓿秋眠性的发现
• 1.5.2 紫花苜蓿秋眠性与温度的关系
• 1.6 紫花苜蓿的分子生物学研究进展
• 1.6.1 国外在紫花苜蓿分子生物学的研究进展
• 1.6.2 国内在紫花苜蓿分子生物学的研究进展
• 1.6.3 苜蓿部分克隆出基因全长的高温胁迫诱导基因
• 1.7 分离差异表达基因的方法
• 1.7.1 mRNA 差异显示技术
• 1.7.2 cDNA 代表性差异分析
• 1.7.3 抑制性消减杂交技术
• 1.7.3.1 抑制性PCR 原理
• 1.7.3.2 SSH 技术原理图
• 1.7.3.3 SSH 具体操作流程
• 1.7.3.4 SSH 技术的特点
• 1.7.3.5 SSH 技术在植物基因克隆上的研究进展
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试剂和酶
• 2.1.3 主要化学试剂
• 2.1.4 试剂盒
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 菌株及载体
• 2.1.7 常用溶液配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 材料的获取
• 2.2.2 总RNA 提取
• 2.2.3 mRNA 分离纯化
• 2.2.4 抑制消减杂交过程（SSH）
• 2.2.4.1 cDNA 第一链的合成
• 2.2.4.2 cDNA 第二链的合成
• 2.2.4.3 限制性内切酶Rsa I 酶切
• 2.2.4.4 苜蓿dscDNA（Tester dscDNA）两端接头的连接
• 2.2.4.5 分析接头连接效率
• 2.2.4.6 第一次杂交（First Hybridization）
• 2.2.4.7 第二次杂交（Second Hybridization）
• 2.2.4.8 第一次PCR 扩增（primer PCR）
• 2.2.4.9 第二次PCR 扩增（Nested PCR）
• 2.2.4.10 消减效率检测
• 2.2.5 PCR 产物的纯化
• 2.2.6 消减文库生成
• 2.2.6.1 载体连接
• 2.2.6.2 连接产物转化
• 2.2.6.3 转化重组子的鉴定
• 2.2.6.4 文库保存
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA 提取
• 3.2 mRNA 的分离纯化
• 3.3 cDNA 合成以及cDNA 酶切效果分析
• 3.4 接头连接效率检测
• 3.5 消减杂交效率的检测
• 3.6 消减PCR 结果
• 3.7 消减文库中插入片段的PCR 鉴定
• 3.8 cDNA 文库的滴度和重组率测定
• 4 阳性差异表达EST 序列生物信息学分析
• 4.1 测序
• 4.2 载体和接头序列的识别与去除
• 4.3 DNA 同源性比对
• 4.4 EST 序列的分类
• 4.5 差异表达克隆中已知基因在抗热性中的相关功能分析
• 4.6 结果与分析
• 5.6.1 测序、序列同源性检测及EST 分类
• 4.6.2 差异表达克隆中已知基因序列的分析
• 4.6.3 差异表达克隆中已知EST 分析
• 4.6.4 差异表达克隆中全新的EST 分析
• 4.6.5 差异表达基因功能分类
• 4.6.6 本试验分离得到的部分片段与已分离的植物抗热相关基因的比较
• 5 讨论与结论
• 5.1 植物材料取样
• 5.2 总RNA 的提取
• 5.3 SSH 各个环节进行实时监控
• 5.4 在克隆转化时，使用DH-5α电转化感受态细胞
• 6 展望
• 参考文献
• Abstract