抗CD20抗体/Flt3L双功能融合蛋白的抗肿瘤作用机理研究

论文摘要

研究目的:尽管Rituximab在临床治疗中已显示出较好的疗效,仍有部分的患者对Rituximab的治疗不产生反应,且单独使用该药治愈率仅为10%,大部分患者会产生复发和抵抗,因此寻求更为有效的CD20抗体或新的结构用于B淋巴瘤的治疗显得尤为迫切。单纯应用抗体的抗肿瘤作用主要基于抗体直接发挥的诱导肿瘤细胞凋亡的作用以及抗体介导的免疫应答（包括补体依赖的细胞裂解和抗体依赖的细胞毒作用）,机体并没有产生有效的抗肿瘤特异性主动免疫反应,对肿瘤产生免疫力。如果能在发挥单抗靶向抗肿瘤作用的同时充分激发机体对肿瘤的特异性主动免疫应答,将单抗对肿瘤的杀伤作用与机体对肿瘤的主动免疫反应有机结合起来,有可能诱导机体产生肿瘤特异性主动免疫反应,解决抗体治疗中存在的肿瘤复发问题。Flt3配体（Flt3 ligand,FL）是一种能够刺激早期造血的细胞因子,可促进树突状细胞（DC）、自然杀伤（NK）细胞的增殖、分化和成熟,具有重要的抗肿瘤作用。因此我们拟构建抗CD20单克隆抗体与FL结合的双功能的融合蛋白,以期获得更为有效的肿瘤靶向治疗药物。研究方法:利用基因工程技术构建两种结构的双功能融合蛋白,分别命名为CD20scFvCH/FlexCL及FlexFc-CD20scFv。利用CHO哺乳动物表达体系,制备双功能融合蛋白,用于蛋白的鉴定以及体内外功能研究。体外研究验证双功能融合蛋白中CD20scFv与CD20+靶细胞的结合功能,与Rituximab竞争结合CD20的功能以及介导CDC、ADCC效应杀伤CD20+靶细胞的功能。体外研究证实双功能融合蛋白中Flex刺激活化DC、NK细胞的功能。体内研究验证双功能融合蛋白的抗肿瘤效应,并探讨其抗肿瘤作用的机理。研究结果:我们通过本项课题的研究获得如下结果:将人FL膜外区与人κ轻链恒定区连接,构建pcDNA3.1/（ZEO+）/FlexCL表达载体,抗CD20抗体Rituximab单链抗体与人IgG1重链恒定区融合,构建了pcDNA3.1/CD20scFvCH真核表达载体。将pcDNA3.1/CD20scFvCH和pcDNA3.1/（ZEO+）/FlexCL两种真核表达载体共转染CHO细胞,筛选得到双功能融合蛋白CD20scFvCH/FlexCL的高表达克隆,并培养纯化用于体内外功能实验所需的目的蛋白。将人FL膜外区与人IgG Fc区连接,再将CD20scFv连接于Fc区的C端,构建成pcDNA3.1/FlexFc-CD20scFv真核表达载体。将pcDNA3.1/FlexFc-CD20scFv真核表达载体转染CHO细胞,筛选得到双功能融合蛋白FlexFc-CD20scFv的高表达克隆,并培养纯化用于体内外功能实验所需的目的蛋白。体外实验证实:CD20scFvCH/FlexCL及FlexFc-CD20scFv中,FLex具有与FLex/Fc相一致的免疫原性及生物学活性,而CD20scFvCH/FlexCL中CD20scFv具有与抗CD20单克隆抗体相近的免疫活性,并能够通过CDC和ADCC效应杀伤Raji、Daudi及NS-1/CD20细胞;FlexFc-CD20scFv中CD20scFv的功能显著弱于CD20scFvCH/FlexCL。体内实验证实:双功能融合蛋白CD20scFvCH/FlexCL对CD20阳性淋巴瘤具有显著疗效,并能有效预防肿瘤的复发。CD20scFvCH/FlexCL的抗肿瘤作用由CD4和CD8阳性T淋巴细胞共同介导,在致敏阶段,CD4阳性T淋巴细胞发挥重要作用,而在免疫效应阶段,CD8阳性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤更有意义。结论:在本课题研究的基础上我们提出抗肿瘤免疫治疗的新概念:利用抗CD20单抗和FL构成的双功能分子在体内不仅能实现单抗本身的特异性抗肿瘤作用,加强NK的杀伤效应,而且还能在体内实现肿瘤抗原对已活化DC的抗原修饰,使DC有效地递呈肿瘤抗原,打破机体对肿瘤的免疫耐受,激发机体产生有效的抗肿瘤特异性主动免疫反应,使机体产生对肿瘤的“特异性免疫力”,防止肿瘤的复发。这个新方法将特异性单抗治疗与肿瘤疫苗这两种较为有效的肿瘤特异性治疗手段有机地结合了起来,是肿瘤疫苗和单抗治疗的优势组合。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 双功能融合蛋白的构建和表达
• 一、材料
• （一） 细胞系
• （二） 载体
• （三） 引物
• （四） 工具酶
• （五） 试剂盒
• （六） 主要仪器设备
• 二、方法
• （一） FlexFc 表达载体的构建
• （二） CD20scFvCH-FlexCL 表达载体的构建
• （三） FlexFc-CD20scFv 表达载体的构建
• （四） 转染、筛选及蛋白表达、纯化和鉴定
• 三、结果
• （一） FlexFc 基因的构建
• （二） CD20scFvCH-FlexCL 基因的构
• （三） FlexFc-CD20scFv 基因的构建
• （四） 表达载体的构建（以FlexFc 为例）
• （五） 瞬时转染鉴定
• （六） 稳定转染及理化性质检测
• 四、讨论
• 第二部分 双功能融合蛋白体外功能鉴定
• 一、材料
• （一） 细胞系
• （二） 主要试剂
• （三） 实验器材
• 二、方法
• （一） 双功能融合蛋白与CD20 的结合活性
• （二） 双功能融合蛋白诱导CD20+细胞的CDC 效应
• （三） 双功能融合蛋白诱导CD20+细胞的ADCC 效应
• （四） 双功能融合蛋白Flex 免疫活性的测定
• （五） 双功能融合蛋白Flex 生物活性的测定
• 三、结果
• （一） 双功能融合蛋白与CD20 的结合活性
• （二） 双功能融合蛋白诱导CD20+细胞的CDC 效应
• （三） 双功能融合蛋白诱导CD20+细胞的ADCC 效应
• （四） 双功能融合蛋白Flex 免疫活性的测定
• （五） 双功能融合蛋白Flex 生物活性的测定
• 四、讨论
• 第三部分 CD205cFvCH-FlexCL 抗肿瘤作用及机理
• 一、材料
• （一） 细胞系
• （二） 实验动物
• （三） 主要试剂
• （四） 实验器材
• 二、方法
• （一） 双功能融合蛋白体内分布研究
• （二） 双功能融合蛋白抗肿瘤作用研究
• （三） 免疫细胞亚群的效应研究
• （四） 特异性抗肿瘤免疫反应研究
• 三、结果
• （一） 双功能融合蛋白体内分布
• （二） 双功能融合蛋白抗肿瘤作用
• （三） 免疫细胞亚群的效应
• （四） 特异性抗肿瘤免疫反应
• 四、讨论
• 参考文献
• 综述：抗CD20 抗体和FLT3L
• 参考文献
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
• 致谢