耐辐射球菌中反应调节蛋白的研究

论文摘要

耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）是世界上最耐辐射的物种之一,对各种DNA损伤介质具有超强的抗性,已成为研究基因组完整性和稳定性的一种理想模式生物。大多原核生物利用双组分系统来感受环境变化;其中的反应调节蛋白可作为一个通用成分来调节胞内系列生命活动。本实验室的研究结果显示,一个被注释为反应调节蛋白的基因DR2418可能对耐辐射球菌的极端辐射抗性具有贡献。于我们重点围绕该基因进行了研究。1.用生物信息学方法搜寻了耐辐射球菌基因组内所有的反应调节蛋白。经序列比对和进化分析得到,与DR2418同源性最高的是DR0781和DR0743。2.对以上三个反应调节蛋白以及与DR2418位于同一操纵子的另外两基因进行了原位突变。结果表明:DR0743不可删除;DR0781对电离辐射抗性不重要;DR2418对电离辐射抗性非常重要;DR2419和DR2420对电离辐射抗性贡献都不大;而ΔDR2418ΔPprI双突变对γ-射线比ΔDR2418和ΔPprI单突变株都更敏感。3.对ΔDR2418突变的特性进行了分析。ΔDR2418突变株对γ-射线、过氧化氢和干燥等DNA损伤试剂的处理都很敏感。突变株的抗氧化能力下降;其胞内重要抗氧化酶KAT和SOD的活性都比野生株低。同时发现两个对DNA修复重要的酶RecA和PprA的表达水平在突变株中都呈下调趋势。双突变ΔDR2418ΔPprI的抗逆性比任何一个单突变都更敏感。4.用DNA微阵列技术分析了突变株相对于野生株的转录谱变化。结果发现,突变株的转录谱都发生了明显的变化,而且突变株中受抑制基因与野生株中受辐射诱导基因有很大一块重叠。实时定量PCR数据支持芯片结果。脉冲场凝胶电泳实验表明DR2418的缺失延长了耐辐射球菌的DNA修复过程,与转录组结果相符。5.验证了DR2418是一个带DNA结合活性的反应调节蛋白。通过蛋白点突变实验,发现Asp54是保守的磷酸化位点。在非磷酸化状态下,DR2418蛋白能与DR0997的启动子特异性结合。6.为探究RecA、PprI和DR2418之间可能存在的关系。我们试图利用串联亲和纯化（TAP）技术获得纯净的体内天然蛋白复合体。目前已将TAP标签直接整合到DNA修复相关基因RecA和DR2418的C端,得到了体内原位表达的融合蛋白RecA-CTAP和DR2418-CTAP,前者已用Western杂交方法进行了验证。另外,我们已在PprI突变株中,分别转入了带TAP标签的功能互补质粒。其中pRADN-PprI互补菌株的功能已通过抗辐射表型得到验证。综上所述,耐辐射球菌的DR2418基因对其极端抗性很重要。它是一个具有特异性DNA结合活性的反应调节蛋白,主要通过调控与细菌抗氧化和DNA修复相关的途径起作用,与DNA修复开关蛋白PprI的功能具有叠加效应。它与重要蛋白的相互关系正在探索之中。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 主要缩略词
• 1 文献综述
• 1.1 耐辐射球菌
• 1.1.1 耐辐射球菌的概况
• 1.1.2 耐辐射球菌的形态、结构和生长特性
• 1.1.3 耐辐射球菌极端抗性机制
• 1.1.3.1 防范机制
• 1.1.3.2 耐受机制
• 1.1.3.3 修复机制
• 1.1.3.3.1 碱基切除修复
• 1.1.3.3.2 核苷酸切除修复
• 1.1.3.3.3 碱基错配修复
• 1.1.3.3.4 重组修复
• 1.1.3.3.5 关于SOS反应和非同源末端重组（NHEJ）
• 1.1.3.3.6 新假说——隐性的DNA双链断裂
• 1.1.4 小结
• 1.2 双组分（组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白）信号转导系统
• 1.2.1 双组分信号转导系统的发现
• 1.2.2 双组分系统的基本结构和作用机制
• 1.2.3 反应调节蛋白的多样性
• 1.2.4 反应调节蛋白在各种生命活动过程中行使功能
• 1.2.4.1 外界胁迫（Stress）
• 1.2.4.2 毒力（Virulence）
• 1.2.4.3 趋化性（Chemotaxis）
• 1.2.4.4 生长调节剂
• 1.2.4.5 外源性大分子DNA的摄取
• 1.2.4.6 内环境稳定（homeostasis）
• 1.2.5 研究双组分（组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白）系统的意义
• 1.3 本文的立论依据和研究意义
• 2 耐辐射球菌反应调节蛋白DR2418的生物信息学分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2.结果与分析
• 2.2.1 DR2418是具DNA结合结构域的OmpR/PhoB类型RR
• 2.2.2 基因DR2418在耐辐射球菌基因组中的位置
• 2.2.3 DR2418的核苷酸序列及氨基酸序列
• 2.2.4 DR2418蛋白的motif在线分析
• 2.2.5 DR2418蛋白结构域的同源性分析
• 2.2.6 耐辐射球菌DR2418同源物进化树分析
• 2.2.6.1 DR2418与其它物种有代表性反应调节蛋白之间的同源性分析
• 2.2.6.2 DR2418与耐辐射球菌内其它反应调节蛋白之间的同源性分析
• 2.3 讨论
• 3 耐辐射球菌DR2418及相关基因突变株的构建
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.1.1 菌株和试剂
• 3.1.2 仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌株培养
• 3.2.2 基因缺失突变菌株的构建方法
• 3.2.2.1 体外"三段连接"
• 3.2.2.2 连接产物转化耐辐射球菌
• 3.2.2.3 突变株的鉴定
• 3.2.3 基因插入突变菌株的构建方法
• 3.2.4 电离辐射处理
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 各种突变菌株的构建
• 3.3.1.1 DR0743缺失突变株的构建
• 3.3.1.2 DR0781插入突变株的构建
• 3.3.1.3 DR2418/DR2419/DR2420突变株的构建
• 3.3.1.4 ΔDR2418ΔPprI双突变株的构建
• 3.3.2 ΔDR0743全突变菌株不能存活
• 3.3.3 ΔDR0781突变菌株对电离辐射不太敏感
• 3.3.4 DR2419/DR2420对电离辐射的贡献不大
• 3.3.5 ΔDR2418ΔPprI对电离辐射更敏感
• 3.4 讨论
• 4 耐辐射球菌DR2418突变株特性分析
• 4.1 材料、试剂与主要设备
• 4.1.1 材料和试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 生长曲线测定
• 4.2.2 突变频率测定
• 4.2.3 突变体功能补偿株的构建
• 4.2.4 菌株抗逆处理
• 4.2.5 耐辐射球菌细胞辐照处理
• 4.2.6 抗氧化活性分析
• 4.2.7 过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性染色分析
• 4.2.8 邻苯三酚自氧化法测SOD活性
• 4.2.9 用过氧化氢酶检测试剂盒检测KAT活性
• 4.2.10 Western blot实验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 突变株MR和野生株R1的生长曲线基本一致
• 4.3.2 突变株MR的自然突变频率没有发生变化
• 4.3.3 突变株MR对各种逆境很敏感
• 4.3.4 突变株MR的抗氧化活性降低
• 4.3.5 突变株MR中RecA蛋白和PprA蛋白表达量下降
• 4.3.6 双突变株ΔDR2418ΔPprI（MD）对各种逆境更敏感
• 4.4 讨论
• 5 耐辐射球菌DR2418突变株转录谱分析
• 5.1.材料与试剂
• 5.1.1 耐辐射球菌基因芯片的制备
• 5.1.2 RNA抽提、逆转录、芯片杂交及Q-RT-PCR所用试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 耐辐射球菌总RNA的分离
• 5.2.2 芯片探针的制备
• 5.2.3 芯片预杂交和杂交
• 5.2.4 芯片扫描及数据分析
• 5.2.5 实时定量PCR
• 5.2.6 耐辐射球菌脉冲场电泳（PFGE）方法
• 5.2.6.1 用凝胶包埋法制备耐辐射球菌基因组
• 5.2.6.2 耐辐射球菌脉冲场电泳流程
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 突变株MR转录谱明显改变
• 5.3.1.1 在自然生长状态下基因DR2418的缺失导致了众多基因转录水平的下调
• 5.3.1.2 电离辐射胁迫下突变株MR的转录谱与非胁迫下的转录谱相似
• 5.3.2 突变株中抑制基因和野生株中辐射诱导基因的重叠
• 5.3.3 Q-RT-PCR方法验证芯片数据
• 5.3.4 DR2418的缺失使γ-射线处理后的基因组重建迟滞
• 5.4 讨论
• 6 耐辐射球菌DR2418蛋白的体外活性研究
• 6.1 材料、试剂与设备
• 6.1.1 菌株与质粒
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 主要仪器与设备
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 大肠杆菌感受态制备
• 6.2.2 DR2418基因的克隆
• 6.2.3 DR2418蛋白表达质粒的构建
• 6.2.4 DR2418蛋白的表达
• 6.2.5 DR2418蛋白的纯化
• 6.2.6 定点突变
• 6.2.7 体外蛋白质磷酸化
• 6.2.8 凝胶迁移实验
• 6.2.9 DR2418蛋白兔多克隆抗血清的制备
• 6.2.10 Western blot实验
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 DR2418基因ORF的实际长度为666 bp
• 6.3.2 DR2418蛋白体外表达量大且可溶
• 6.3.3 氨基酸位点Asp54突变使DR2418蛋白失活
• 6.3.4 DR2418蛋白能与基因DR0997的启动子特异性结合
• 6.3.5 电离辐射前后耐辐射球菌体内基因DR0997的动态转录水平
• 6.3.6 突变体YR1中DR2418蛋白表达量下降
• 6.4 讨论
• 7 利用TAP技术研究耐辐射球菌体内蛋白互作
• 7.1 材料与试剂
• 7.1.1 质粒、材料和主要试剂
• 7.1.2 溶液的配制
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 耐辐射球菌细胞内的质粒提取
• 7.2.2 用SOE法进行体外三段连接
• 7.2.3 TAP标签的选择
• 7.2.4 样品的制备及纯化过程
• 7.2.4.1 细胞抽提液的准备
• 7.2.4.2 上清液与IgG树脂结合
• 7.2.4.3 用TEV蛋白酶切割标签
• 7.2.4.4 洗脱液与Calmodulin树脂结合
• 7.2.4.5 从Calmodulin树脂上洗脱下来
• 7.2.5 TEV蛋白酶的表达与纯化
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 pBS1479∶∶KANA质粒的构建
• 7.3.2 pRADN和pRADC质粒的构建
• 7.3.3 RecA-CTAP原位融合表达菌株的构建
• 7.3.4 DR2418-CTAP原位融合表达菌株的构建
• 7.3.5 PprI-CTAP和NTAP-PprI互补融合表达菌株的构建
• 7.3.6 靶蛋白（与TAP标签融合）互作蛋白的筛选
• 7.4 讨论
• 8 总结与展望
• 参考文献
• 作者简历