首页> 正文

慢病毒载体介导的siRNA/shRNA抑制禽流感病毒转基因鸡的研究

2020-12-02阅读(1037)

慢病毒载体介导的siRNA/shRNA抑制禽流感病毒转基因鸡的研究

论文摘要

本实验采用RNA干涉（RNAi）的方法开展抗禽流感病毒转基因鸡的研究,首先将禽流感病毒H9N2毒株核蛋白基因（NP）插入真核表达载体pL-EGFP中EGFP的上游,获得了NP-EGFP融合基因表达载体pL-NP-EGFP作为禽流感病毒siRNA筛选质粒,继而针对AⅣ各亚型核蛋白基因（NP）的保守序列,设计合成三对shRNA,并退火接入带有PolⅢH1启动子的干涉质粒（pSUPER-basic-H1）,分别命名为:pSUPER-siNP1、pSUPER-siNP2、pSUPER-siNP3。重组质粒经双酶切鉴定并测序确认。将此干涉质粒与NP基因筛选质粒pL-NP-EGFP（NP/EGFP infusion gene）共转染鸡胚成纤维细胞,较其他两个干涉质粒,pSUPER-siNP3高效抑制了NP基因的表达,为进一步确认比较此重组质粒对AⅣ的抑制,本实验进行了禽流感hemagglutination（HA）滴度和TCID50测定,重复三次均获得相似结果,pSUPER-siNP3转染组H9N2的TCID50分别降为:10-5.00/0.1 mL;10-5.16/0.1mL;10-5.28/0.1mL;HA效价降为:1:4。而未转染干涉质粒禽流感病毒对照组TCID(（50）为:10-8.50/0.1 mL,HA效价为:1:256。利用该高效干涉片段本实验构建了pLenti6-siNP3-EGFP慢病毒表达载体,并进一步确认比较了慢病毒表达质粒的干涉效果:pL-NPi-EGFP转染组H9N2的TCID50降为:10-5.16/0.1 mL,HA效价降为:1:4;而未转染干涉质粒禽流感病毒对照组H9N2的TCID50为:10-8.33/0.1 mL,HA效价为:1:256。最后将慢病毒表达载体与辅助质粒共转染293 FT细胞生产病毒颗粒。将病毒浓缩后胚下腔显微注射转染鸡胚,孵化率达10%（12/120）,结果在检测的12只受体鸡胚胎中,有4只发生嵌合。

论文目录

  • 符号及缩略语等的说明
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一部分 文献综述
  • 第一章 禽流感及对禽流感病毒的防治
  • 1 定义
  • 2 禽流感的历史及流行新特点
  • 2.1 禽流感的历史
  • 2.2 禽流感的流行新特点
  • 3 病原
  • 3.1 病原的分类和命名
  • 3.1.1 流感病毒的分类
  • 3.1.2 流感病毒的命名法则
  • 3.2 流感病毒的形态和结构
  • 3.3 流感病毒的化学组成
  • 4 禽流感病毒的分子生物学特征
  • 4.1 禽流感病毒的基因组成
  • 4.2 禽流感病毒基因编码蛋白功能
  • 4.2.1 聚合酶蛋白
  • 4.2.2 血凝素
  • 4.2.3 核蛋白
  • 4.2.4 神经氨酸酶
  • 4.2.5 基质蛋白
  • 4.2.6 非结构蛋白
  • 5 禽流感病毒的复制
  • 5.1 吸附、穿膜和蜕壳
  • 5.2 基因组的转录与复制
  • 5.3 病毒蛋白的合成
  • 5.4 病毒粒子的装配
  • 5.5 病毒的出芽和释放
  • 6 禽流感病毒的遗传变异
  • 7 禽流感病毒对理化因素的抵抗力
  • 8 禽流感的致病机理
  • 9 H9N2亚型禽流感
  • 9.1 H9N2 AIV的分子演化
  • 9.2 H9N2 AIV的受体特异性
  • 10 禽流感的流行病学
  • 10.1 发病季节
  • 10.2 传染源
  • 10.3 传播方式
  • 10.4 宿主范围
  • 10.5 易感日龄
  • 10.6 易感季节
  • 10.7 传播媒介
  • 10.8 潜伏期
  • 10.9 发病率和死亡率
  • 10.10 临床症状
  • 11 疫苗和药物预防禽流感
  • 第二章 LV-RNAi法预防禽流感
  • 1 LV载体的应用
  • 2 LV-siRNA技术
  • 第三章 转基因鸡的研究进展
  • 1 转基因鸡的制备方法
  • 1.1 慢病毒载体法
  • 1.2 原始生殖细胞介导法
  • 1.3 精子载体法
  • 1.4 显微注射法
  • 2 转基因鸡研究存在的问题
  • 3 本实验的目的和意义
  • 第二部分 试验研究
  • 第四章 禽流感病毒核蛋白基因（NP）siRNA筛选体系的建立
  • 1 材料与方法
  • 1.1 NP-eGFP融合基因表达载体的构建
  • 1.1.1 实验材料
  • 1.1.2 禽流感病毒的繁殖
  • 1.1.3 病毒RNA的提取
  • 1.1.4 RT-PCR反应
  • 1.1.5 PCR产物的回收与纯化
  • 1.1.6 pL-EGFP双酶切及载体片段的回收
  • 1.1.7 目的基因DNA产物的连接与转化
  • 1.2 CEF细胞的转染和表达产物的荧光检测
  • 1.3 NP基因表达的RT-PCR检测
  • 2 结果与分析
  • 2.1 融合基因表达载体pL-NP-EGFP的构建
  • 2.2 pL-NP-EGFP融合基因在CEF中的表达
  • 2.3 CEF细胞中pL-NP-EGFP基因表达的RT-PCR检测
  • 3 讨论
  • 第五章 质粒介导的siRNA/shRNA高效抑制A型禽流感复制靶位点的筛选
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 siRNA片段的设计
  • 1.2.2 单链寡核苷酸的退火
  • 1.2.3 干涉重组质粒的构建与鉴定
  • 1.2.4 重组质粒转化CEF
  • 1.2.5 禽流感病毒感染与病毒滴度测定
  • 2 结果与分析
  • 2.1 重组质粒的双酶切鉴定
  • 2.2 CEF中EGFP表达的荧光检测
  • 50及HA效价的测定'>2.3 pSUPER-siNP3转染CEF后AIV病毒TCID50及HA效价的测定
  • 3 讨论
  • 第六章 胚下腔显微注射具有高效抑制性的shRNA慢病毒干涉载体转染鸡胚生产转基因鸡
  • 1 材料与方法
  • 1.1 试验材料
  • 1.1.1 种蛋来源
  • 1.1.2 主要试剂
  • 1.1.3 主要仪器设备
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 慢病毒转运载体质粒的构建
  • 1.2.2 慢病毒干涉载体质粒的构建
  • 1.2.3 慢病毒转运载体质粒的鉴定
  • 1.2.4 慢病毒干涉载体的鉴定
  • 1.2.5 进一步检测慢病毒干涉载体对禽流感NP基因的抑制作用
  • 1.2.6 病毒辅助质粒的扩增鉴定
  • 1.2.7 293FT细胞的培养
  • 1.2.8 病毒的生产
  • 1.2.9 病毒滴度分析
  • 1.2.10 病毒鸡胚注射
  • 1.2.11 转基因个体PCR分析
  • 2 结果
  • 2.1 病毒转运载体鉴定
  • 2.2 病毒干涉载体的扩增鉴定
  • 2.3 慢病毒干涉载体对AIV病毒的抑制
  • 2.4 病毒包装质粒的扩增鉴定
  • 2.5 病毒滴度分析
  • 2.6 病毒转染后细胞表型的变化
  • 2.7 病毒在不同细胞中的表达特征
  • 2.8 转基因个体PCR分析
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 附录
  • 1 主要试剂的配置
  • 1.1 PBS溶液
  • 1.2 0.25%胰蛋白酶
  • 1.3 抗生素的配置
  • 1.4 293FT细胞培养液的配置
  • 1.5 LB培养基配置
  • 1.6 质粒快速提取法所需试剂
  • 1.7 DNA提取所所需试剂
  • 2 主要附图
  • 2.1 三对RNA干涉片段的测序图
  • 2.2 主要质粒构建图
  • 2.2.1 干涉基本质粒的构建
  • 2.2.2 慢病毒转运载体的构建
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].2013—2018年禽流感流行情况及其监测和预防[J]. 农业开发与装备 2019(11)
    • [2].2011—2018年宁夏吴忠市外环境禽流感病毒监测分析[J]. 宁夏医科大学学报 2019(09)
    • [3].两种禽流感病毒含量测定方法的比较[J]. 福建畜牧兽医 2020(01)
    • [4].海口市培龙活禽市场家禽禽流感病毒携带情况分析[J]. 中国卫生产业 2020(13)
    • [5].禽流感病毒冬季流行特点、形势和防疫[J]. 饲料博览 2020(09)
    • [6].浙江省临海市2016—2019年禽流感病毒外环境监测结果分析[J]. 中国预防医学杂志 2020(05)
    • [7].2016—2018年南昌市活禽市场禽流感病毒监测结果分析[J]. 职业与健康 2020(16)
    • [8].禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法的建立[J]. 中国兽医学报 2018(12)
    • [9].禽流感疾病的预防控制思路探讨[J]. 农村实用技术 2019(05)
    • [10].2016年广州市禽类交易市场禽流感病毒监测与分析[J]. 中国卫生检验杂志 2018(05)
    • [11].我国禽流感的研究进展及成就[J]. 当代畜禽养殖业 2018(06)
    • [12].加强监测,从源头控制和根除家禽流感病毒[J]. 北方牧业 2018(15)
    • [13].不同禽流感病毒实时荧光RT-PCR试剂盒的比较[J]. 黑龙江畜牧兽医 2016(24)
    • [14].韩国检出新型禽流感病毒[J]. 吉林畜牧兽医 2017(02)
    • [15].面对H7N9我们应该知道什么?[J]. 兽医导刊 2017(05)
    • [16].科技[J]. 中国畜牧业 2017(01)
    • [17].禽流感病毒对人类致病的研究概述[J]. 饲料与畜牧 2017(20)
    • [18].2013—2014年湖北省外环境中禽流感病毒污染情况分析[J]. 微生物与感染 2016(03)
    • [19].禽流感病毒致急性肺损伤机制及中医证治研究进展[J]. 中国中医急症 2015(03)
    • [20].刘迎芳:攻克禽流感病毒“核心”[J]. 发明与创新(综合版) 2009(04)
    • [21].H5N6不是新病毒[J]. 发明与创新(大科技) 2016(03)
    • [22].禽流感预防与控制以及相关因素的研究[J]. 饮食科学 2018(10)
    • [23].浅谈三鸟批发市场禽流感的预防措施[J]. 明日风尚 2016(22)
    • [24].我国在H5N6禽流感病毒研究中取得突破[J]. 农业知识 2017(06)
    • [25].江苏:鸡蛋交易平稳,猪肉销量增长明显[J]. 农产品市场周刊 2017(03)
    • [26].禽流感又起,还能安心吃鸡吗?[J]. 时尚育儿 2017(04)
    • [27].怎样吃到美味又营养的溏心蛋[J]. 中国食品 2017(08)
    • [28].“流感”这么多,哪里不一样?[J]. 创新时代 2017(04)
    • [29].穿羽绒服会得禽流感?[J]. 百科知识 2017(08)
    • [30].蛋鸡温和型禽流感如何防控[J]. 农村科学实验 2017(03)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    慢病毒载体介导的siRNA/shRNA抑制禽流感病毒转基因鸡的研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5