解淀粉芽孢杆菌PEBA20与细菌群体行为相关基因研究

论文摘要

本研究主要检测了解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） PEBA20的群体淬灭基因aiiA,并对其群体淬灭功能进行了分析;分析了生物膜形成相关的yqxM-sipW-tasA操纵子及sinR基因,并构建sinR突变株,验证了其对生物膜形成的功能。主要研究结果如下:1.从B. amyloliquefaciens PEBA20基因组中克隆得到了aiiA基因,测序表明,该aiiA基因含有753个碱基的开放阅读框,同Genbank中提交的其它芽孢杆菌种aiiA类似基因具有很高的同源性。该基因为首次从B. amyloliquefaciens中获得。2.构建了aiiA基因融合表达载体pEASY-E1/aiiA并转入到大肠杆菌（Escherichia coli BL21 DE3）中过量表达。SDS-PAGE电泳表明,融合蛋白得到正确表达。其大小为28kDa。将aiiA基因表达产物进行功能分析发现,该AiiA融合蛋白对胡萝卜软腐病菌（Pectobacterium carotovorum subsp.）侵染胡萝卜具有很好的抑制作用。3.克隆了B. amyloliquefaciens PEBA20中yqxM-sipW-tasA操纵子,测序结果表明,yqxM操纵子共有2078个碱基,tasA基因包含有786个碱基的开放阅读框, yqxM基因包含有672个碱基的开放阅读框。tasA基因的存在范围比较广,且相似度在65%-98%之间。sipW基因和yqxM基因在BLAST结果中只在B. amyloliquefaciens、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）中有所发现。4.构建了pEASY-T1空载体并以pEASY-T1质粒为模板扩增卡那霉素抗性基因（knar）,将kna基因构建到pMD18-T中并转入到E. coli DH5α,最终,获得了含有pMD18-T-kna的重组菌并能够成功表达kna抗性基因。5.根据B. amyloliquefaciens FZB42基因组序列设计引物,以B. amyloliquefaciens PEBA20染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增sinR基因上游约650bp和基因下游600bp的两端DNA序列作为打靶载体的同源长、短臂,将此两段序列按同一方向分别插入骨架质粒pMD18-T-kna中knar表达单元的5’端和3’端,构成重组质粒pMD18-T-kna-sinR作为基因打靶载体。6.将构建好的sinR基因打靶载体用HindⅢ单酶切线性化后,电转化至B. amyloliquefaciens PEBA20感受态中,50μg mL-1卡那霉素抗性平板筛选。利用PCR鉴定方法筛选PEBA20基因缺失株,检测16个抗性转化子确定基因突变株。其中,6号转化子检测到目的条带,结果表明,sinR基因打靶载体成功进行重组。生物膜表型检测表明,sinR基因突变株在固体和液体培养基中较野生株均形成了结构更复杂的生物膜。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 群体感应系统（quorum sensing，QS）
• 1.2 aiiA 基因
• 1.2.1 aiiA 基因的作用
• 1.2.2 AiiA 蛋白在生物防治方面的研究
• 1.3 生物膜简介
• 1.4 两种群体行为的联系
• 1.4.1 群体感应与生物膜关系
• 1.4.2 aiiA 与生物膜关系
• 1.5 生物膜相关基因
• 1.6 基因打靶技术
• 1.6.1 同源重组技术
• 1.6.2 以抗性基因为筛选标记的双交换同源重组
• 1.6.3 结合了反向筛选标记的两步但交换同源重组
• 1.7 实验目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶和生化试剂
• 2.1.3 溶液及培养基配制
• 2.1.3.1 培养基配制
• 2.1.3.2 溶液配制
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 引物设计
• 2.2 方法
• 2.2.1 Bacillus. amyloliquefaciens PEBA20 aiiA 基因克隆
• 2.2.1.1 基因组DNA 的提取
• 2.2.1.2 B.amyloliquefaciens PEBA20 的aiiA 基因扩增
• 2.2.1.3 PCR 产物回收
• 2.2.1.4 aiiA 基因扩增产物和pMD18-T 克隆载体的连接
• 2.2.1.5 大肠杆菌DH5α感受态的制备（采用CaC12法）
• 2.2.1.6 连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞
• 2.2.1.7 菌落PCR 检测
• 2.2.1.8 质粒提取及重组克隆质粒的酶切鉴定
• 2.2.1.9 序列测定
• 2.2.2 序列分析
• 2.2.3 AiiA 融合蛋白的原核表达
• 2.2.3.1 表达载体的构建
• 2.2.3.2 阳性重组子的鉴定
• 2.2.3.3 IPTG 诱导表达
• 2.2.3.4 SDS-PAGE 电泳
• 2.2.4 AiiA 蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌抗病性测定
• 2.2.4.1 胡萝卜块的制备
• 2.2.4.2 AiiA 蛋白样品的制备
• 2.2.4.3 感染样品
• 2.3 tasA-sipW-yqxM 操纵子的克隆
• 2.3.1 tasA 基因和sipw-yqxM 基因的扩增
• 2.3.2 PCR 产物回收与连接
• 2.3.3 连接产物的转化与验证
• 2.3.4 yqxM 操纵子的序列分析
• 2.4 sinR 基因突变株的构建
• 2.4.1 卡那霉素抗性质粒pMD18-T-kna 的构建
• 2.4.1.1 pEASY-T1 空载体的构建
• 2.4.1.2 卡纳抗性基因的扩增
• 2.4.1.3 pMD18-T-kna 的构建
• 2.4.2 pMD18-T-kna-sinR-Front 的构建
• 2.4.2.1 sinR 基因同源前臂的扩增
• 2.4.2.2 质粒pMD18-T-kna 以及同源前臂sinR F 的双酶切反应
• 2.4.2.3 PCR 酶切产物与质粒酶切产物连接
• 2.4.2.4 连接产物的转化及验证
• 2.4.3 pMD18-T-kna-sinR 的构建
• 2.4.3.1 sinR 基因同源后臂的扩增
• 2.4.3.2 质粒pMD18-T-kna-sinRF 以及同源后臂sinRB 的双酶切反应
• 2.4.3.3 PCR 酶切产物与质粒酶切产物连接
• 2.4.3.4 连接接产物的转化及验证
• 2.4.4 B.amyloliquefaciensPEBA20 的电转化
• 2.4.4.1 B.amyloliquefaciensPEBA20 感受态的制备
• 2.4.4.2 电转化
• 2.4.4.3 sinR 基因缺失菌株的筛选及PCR 检测
• 2.4.4.4 sinR 基因缺失菌株的形态学测定
• 3 结果与分析
• 3.1 aiiA 基因克隆
• 3.1.1 B.amyloliquefaciens PEBA20 染色体DNA 的提取
• 3.1.2 aiiA 基因的克隆
• 3.1.3 aiiA 基因的序列分析
• 3.2 aiiA 基因的表达
• 3.2.1 重组表达质粒pEASY-E1/aiiA 的构建
• 3.2.2 AiiA 蛋白的功能分析
• 3.3 yqxM 操纵子的克隆与分析
• 3.3.1 yqxM 操纵子的克隆
• 3.3.2 yqxM 操纵子分析
• 3.4 sinR 基因突变株构建
• 3.4.1 pMD18-T-kna 载体的构建
• 3.4.2 同源前臂sinR-front 的克隆
• 3.4.3 同源后臂sinR-back 的克隆
• 3.4.4 sinR 基因打靶载体的构建
• 3.4.5 sinR 基因缺失菌株的筛选及PCR 检测
• 3.4.6 sinR 基因缺失株的形态学测定
• 3.4.6.1 固体培养基表面的生物膜形态
• 3.4.6.2 液体培养基表面的生物膜形态
• 4 讨论
• 4.1 aiiA 基因的鉴定与功能
• 4.2 yqxM 操纵子的克隆和分析
• 4.3 sinR 基因突变株的构建
• 4.3.1 sinR 基因的确定
• 4.3.2 打靶载体骨架质粒的选择
• 4.3.3 靶基因同源序列的克隆
• 4.3.4 外源DNA 导入宿主细胞
• 4.3.5 同源重组转化子的筛选和鉴定
• 4.3.6 sinR 基因对生物膜形成的影响
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况
• 硕士学位论文内容简介及自评