青春期至成年早期双酚A暴露对小鼠行为的影响及其分子机制

论文摘要

双酚A（bisphenol A, BPA）是酚类化合物中具代表性的一类环境雌激素污染物,多应用于食品和饮料碳酸聚酯包装材料、金属罐头树脂内膜、牙齿固封剂等。作为一种类雌激素,BPA与雌激素受体具有一定的亲和性,能模拟和干扰体内雌激素的正常代谢和生理活动。尤其是在组织形成和发育时期,对人类健康造成严重威胁。许多研究发现围生期BPA暴露影响啮齿类脑和行为的发育。本实验室前期工作发现,围生期BPA暴露影响子代小鼠的多种社会行为及其性别分化。青春期是动物机体发育的第二个高峰时期,其行为也受性激素的调节,因此推测青春期BPA暴露也可能影响小鼠的非生殖行为。突触可塑性包括突触结构修饰和突触功能的可变性,容易受行为、环境和药物的影响,与学习记忆等行为密切相关。PSD-95 （post synaptic density protein 95）是突触后致密体（PSD）上具有代表性的脚手架蛋白,可对信号转导分子进行整合而调节突触活动,谷氨酸NMDA受体是兴奋性突触的突触后必需组份,它们的表达均受内源性雌激素影响。因此,本研究进一步分析突触结构修饰、突触蛋白和NMDA受体与青春期BPA暴露对小鼠自发活动、探究、焦虑以及学习记忆行为影响的关系,初步探索青春期BPA暴露对动物行为影响的分子机制。方法：取体重18-23 g,4周龄清洁级ICR小鼠,适应1周后,按性别随机分为40、400μg/kg/day BPA染毒组和对照组,每组10只；从第5周每天早8点灌胃染毒持续8周,然后进行开场、高架十字迷宫、水迷宫和跳台行为检测,分别检测小鼠的自发活动行为、探究行为、焦虑行为、空间学习记忆行为和被动回避记忆行为。染毒至行为检测结束（共9周半）。对照组等体积灌胃溶媒花生油。行为测试结束后,处死小鼠,按要求取海马组织样品,分别做超薄切片电镜观察海马突触界面参数、HE病理切片检查CA1区形态变化、免疫组化技术检测CA1区PSD-95蛋白表达,western-blot技术检测海马NMDA受体NR1和NR2B亚基表达；同时检测体重、血清雌激素或雄激素水平。用Quantity one软件测定蛋白条带光密度值,用Image-Pro Plus 5.0分析测定免疫细胞化学图片。最后实验数据采用SPSS15.0统计软件中的One-way ANOVA法分析,进行t检验,P<0.05作为具有统计学差异显著性。结果：1、40和400μg/kg/d剂量的BPA组的雄鼠和40μg/kg/d剂量BPA组的雌鼠体重均明显低于正常对照组（P<0.05）,此外,同一BPA处理组雄鼠体重均显著高于雌鼠（P<0.01）；小鼠血清激素水平检测表明,BPA对雌、雄小鼠血清雌激素、睾酮激素没有影响。2、BPA暴露后,开场行为结果显示：BPA暴露不影响同性别小鼠在开场中的各种行为,但消除了悬空站立和扶壁站立频率的性别差异。高架十字迷宫行为结果表明：BPA暴露显著减少雄鼠进入开放臂的次数和停留时间（P<0.05和P<0.01）,却显著增加雌鼠进入开放臂的次数和停留时间（P<0.05和P<0.01）；同时,BPA暴露显著减少雄鼠（P<0.05和P<0.01）却增加雌鼠在中央区的探头次数（P<0.01）,消除甚至反向诱导小鼠焦虑行为和探究行为的性别分化。水迷宫行为显示：BPA（40μg/kg/d）暴露显著延长雄鼠在水迷宫中搜寻平台的平均距离（P<0.05）,但对雌鼠没有影响,BPA因此消除了正常成年小鼠空间记忆行为的性别差异。BPA（40μg/kg/d）暴露显著缩短了雄鼠在遭电击24h后跳下平台的潜伏期（P<0.05）但对雌鼠没有明显影响,并诱导成年小鼠被动回避行为性别差异。3、突触界面结构参数检测结果显示,BPA暴露没有影响突触数密度,但BPA （40、400μg/kg/d）暴露改变了突触界面结构修饰。与同性别对照组相比,BPA（40、400μg/kg/d）显著增大雌、雄小鼠突触间隙宽度（P<0.05或P<0.01）,减小雌、雄小鼠PSD厚度（P<0.05或P<0.01）,显著缩短雌、雄小鼠的活性带长度（P<0.05或P<0.01）,对突触界面曲率没有影响。此外,BPA暴露40μg/kg/d的BPA使突触间隙宽度出现明显的性别差异（P<0.05）,表现为雌鼠大于雄鼠。4、HE染色结果显示,BPA暴露对小鼠海马CA1区形态结构没有显著影响；但免疫组化技术检测到BPA（40、400μg/kg/d）暴露使雌、雄小鼠海马CA1区PSD95蛋白表达显著下降（P<0.05或P<0.01）；进一步Western blot分析发现,BPA （40、400μg/kg/d）暴露显著下调雌、雄小鼠海马NMDA受体NR1和NR2B亚基表达（P<0.01）,其中40μg/kg/d的BPA对雄性小鼠NR1和NR2B亚基的下调作用更明显,不仅消除了正常小鼠NR1亚基表达的性别差异,同时还逆转了正常小鼠NR2B亚基表达的性别差异（雄鼠<雌鼠,P<0.01）。结论：青春期至成年早期BPA暴露性别特异性地影响小鼠的多种行为,干扰成年小鼠行为的性别差异,这可能与BPA改变海马突触界面结构修饰、下调突触蛋白PSD-95表达和NMDA受体表达有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1 BPA概述
• 2 雌激素与脑发育
• 3 雌激素与突触界面结构修饰及PSD-95
• 4 NMDA受体与神经系统发育
• 5 BPA对行为的影响
• 6 本研究的目的和意义
• 第二章 青春期至成年早期BPA暴露对小鼠生长发育的影响
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 青春期至成年早期BPA暴露对小鼠行为的影响
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四章 青春期至成年早期BPA暴露对突触界面结构修饰及PSD-95表达影响
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第五章 青春期至成年早期BPA暴露对小鼠海马NMDA受体影响
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
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