枯草芽孢杆菌Tat分泌表达青霉素G酰化酶初步研究

论文摘要

青霉素G酰化酶（Penicillin G Acylase,EC.3.5.1.11,简称PGA）是β-内酰胺类抗生素工业中最为关键的酶。提高PGA的生物合成活力将促进β-内酰胺类抗生素的酶法高效生产。目前大多数的蛋白都以包涵体的形式在胞质中生成,由于这种方法生成的蛋白存在复性困难这一问题,所以人们将目光移向原核生物的分泌表达。将外源蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现有效分泌表达,在穿膜的过程中,信号肽被信号肽酶切除,分泌表达的蛋白质和天然的产物是一致的。Bacillus subtilis是很有潜力的分泌型基因工程宿主菌, Bacillus subtilis分泌表达蛋白质主要有两种途径,一种是Sec（Sec-dependent translocation）途径,一种是Tat（twin-arginine translocation）途径。Sec途径主要有两个瓶颈:一是不能转移在细胞质中已折叠好的蛋白质,另一个是外源蛋白转移到膜外后折叠缓慢且来不及折叠就会被蛋白酶降解。而Tat途径的功能是转运那些折叠迅速或紧密的蛋白质甚至是多亚基酶复合物,这些蛋白无法通过Sec途径分泌。本研究利用基因工程和发酵工程技术,开展对枯草芽孢杆菌Tat分泌表达青霉素G酰化酶初步研究,获得以下结果:1.构建了Tat信号肽检测载体。克隆了来源于Bacillus megaterium（ATCC14945）的pga基因（Genbank登录号BMU07682）。利用枯草芽孢杆菌的强启动子P43基因以及720bp的GFP基因片断构建了Tat信号肽检测载体pYGGFP。克隆枯草芽孢杆菌蔗糖-6-果糖转移酶信号肽SacB基因替换720bp的GFP基因,构建的表达载体转化WB700进行表达,验证信号肽检测载体的有效性。试验结果表明SacB信号肽成功引导PGA胞外分泌,证明了Tat信号肽检测载体是有效的。2.克隆了来源于Bacillus subtilis168基因组（Genbank登录号NC 000964）的24个Tat信号肽基因,构建了24个装有Tat信号肽的PGA表达载体,并进行分泌表达PGA的研究。通过NIPAB滤纸法测定菌落PGA酶活,筛选到了四个表达系统,分别是pYGAlbB、pYGYmzC、pYGAmyX、pYGLipA（分别克隆有信号肽AlbB、YmzC、AmyX、LipA）,能够在WB700中分泌表达PGA,培养36h PGA酶活分别为0.21U·ml-1、0.26 U·ml-1、0.11 U·ml-1、0.08 U·ml-1。证明了合适的枯草芽孢杆菌Tat信号肽能够使Bacillus megateriumPGA在枯草芽孢杆菌中分泌表达。3.构建了Pglv启动子调控的PGA大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭载体。PGA酶活测定结果表明Pglv启动子调控PGA表达的效果优于P43。说明了P43启动子构建的载

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 枯草芽孢杆菌分泌表达研究进展
• 1.1 青霉素 G 酰化酶简介
• 1.2 枯草芽孢杆菌分泌表达途径研究
• 1.3 影响枯草杆菌蛋白分泌的因素和分泌瓶颈
• 1.4 枯草杆菌表达系统存在问题和发展方向
• 1.5 枯草杆菌Tat途径机制
• 1.6 Tat 系统的组成和遗传学
• 1.7 Tat 途径转运折叠蛋白的研究进展
• 1.8 联精氨酸信号肽的研究进展
• 第二篇 试验研究（枯草芽孢杆菌Tat 分泌表达青霉素G 酰化酶初步研究）
• 第二章 研究的目的和意义
• 第三章 信号肽检测载体的构建
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 Bacillus megaterium ATCC14945 的PGA 基因序列
• 3.3.2 GFP 基因PCR 及TA 克隆鉴定
• 3.3.3 质粒构建
• 3.4 讨论
• 第四章 枯草芽孢杆菌Tat 信号肽的克隆及分泌表达PGA 的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 Bacillus subtilis24 个Tat 信号肽基因
• 4.3.2 含枯草芽孢杆菌Tat 信号肽的24 个表达载体的构建
• 4.3.3 青霉素G 酰化酶的分泌性表达
• 4.3.4 PGA 的 SDS-PAGE
• 第五章 不同表达元件对Tat 信号肽调控PGA 表达的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 P43 和Pglv 的基因启动子结构分析
• 5.3.2 PGA 的活力测定
• 5.4 讨论
• 第六章 枯草芽孢杆菌Tat 信号肽分泌PGA 性能优化研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 信号肽的 SignalP 分析结果
• 6.3.2 信号肽的定点突变结果
• 6.3.3 PGA 的分泌性表达
• 6.3.4 PGA 的SDS-PAGE 分析
• 第七章 PGA 在 WB700 中分泌表达条件的研究
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 材料
• 7.2.2 枯草芽孢杆菌感受态的制备、转化和PGA 的酶活测定方法都参照第二章相关内容
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 培养温度对PGA表达的影响
• 7.3.2 培养基起始pH 值对PGA 表达的影响
• 7.3.3 培养基碳源对PGA表达的影响
• 第八章 枯草芽孢杆菌通用型Tat分泌表达体系探讨
• 8.1 引言
• 8.2 材料与方法
• 8.2.1 材料
• 8.2.2 方法
• 8.3 结果与讨论
• 8.3.1 bga 基因序列分析
• 8.3.2 β-半乳糖苷酶的分泌性表达
• 8.3.3 β-半乳糖苷酶的 SDS-PAGE
• 结论
• 参考文献
• 致 谢
• 作者简介