血红素加氧酶1介导氢气和抗坏血酸增强紫花苜蓿非生物胁迫耐性的分子机理

论文摘要

近年来,动物中的研究表明氢气（hydrogen gas,H2）可以作为重要的信号分子调节动物抗氧化、抗炎症和抗凋亡的能力,然而其在植物中的功能及信号转导途径尚不明确；此外,抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）在缓解镉胁迫中起到重要的作用,但是AsA作用的机制和相关信号通路仍不清楚。因此,我们针对上述问题展开了研究,取得了以下的主要结果：1、百草枯（paraquat,PQ）胁迫可以诱导紫花苜蓿幼苗内H2的产生。当以富氢水（hydrogen-rich water,HRW）的形式给植物供给H2,发现HRW可以显著增强紫花苜蓿对PQ造成的氧化伤害的耐性；主要表现为HRW处理可以缓解PQ对幼苗根生长的抑制、减少脂质过氧化和降低组织中过氧化氢（H202）和超氧阴离子（02-）的含量。另外,H2可以诱导细胞内一些代表性抗氧化酶的活性与转录本。进一步的研究发现,H2预处理可以显著增加紫花苜蓿血红素加氧酶1（HO1）基因的表达水平、蛋白含量和HO酶活性；H2的缓解作用可以被HO活性抑制剂锌原卟啉IX（zinc protoporphyrin IX,ZnPP）所抑制,而这种抑制作用又能被HO1催化反应产物一氧化碳（carbon monoxide, CO）所逆转。此外,我们还发现H2预处理可以增强紫花苜蓿对其它多种环境胁迫的耐性。这些结果暗示着H2可能是紫花苜蓿抵御环境胁迫过程中的一个重要的信号分子,并可能通过HO1介导其保护作用。2、脱落酸（abscisic acid, ABA）和干旱胁迫可以显著诱导紫花苜蓿组织中H2的产生。以HRW的形式给紫花苜蓿供给H2可以显著增强其对外源ABA的敏感性,包括种子的发芽率、根的伸长和气孔关闭；同时HRW处理的幼苗中H2O2含量在有外源ABA处理或受到水分胁迫时显著的比未处理的高,并能增强紫花苜蓿对干旱胁迫的耐性。进一步的药理学实验表明,NADPH氧化酶抑制剂二甲基苯碘（diphenyleneiodonium, DPI）和H202化学清除剂N,N’-二甲基硫脲（N,N’-dimethylthiourea, DMTU）可以抑制HRW对紫花苜蓿幼苗干旱胁迫耐性的增强作用。随后研究发现,HRW和干旱处理可以显著提高紫花苜蓿幼苗叶片质外体的pH；使用H+-ATPase抑制剂钒酸盐（vanadate）进行处理,结果表明vanadate可以显著缓解H2对质外体汁液pH的碱化作用和增加气孔对ABA和缺水敏感性的作用。以上结果表明H2调节质外体汁液pH和气孔关闭通过一条依赖于ABA信号途径的机制,并暗示H2可能是紫花苜蓿ABA依赖的干旱胁迫响应中新的正调控因子。3、镉（cadmium,Cd）胁迫导致紫花苜蓿幼苗受到严重的氧化伤害并显著降低组织内AsA含量；外源添加AsA不仅可以增加幼苗内源AsA的含量,而且可以进一步促进镉诱导HO1表达和活性；此外,AsA可以降低幼苗根部对镉的积累和镉胁迫造成的氧化伤害。HO1的抑制剂ZnPP可以抑制AsA的上述作用,外源添加HO1两个催化反应产物50%饱和CO水溶液或胆红素（bilirubin,BR）可以逆转ZnPP的抑制作用。AsA对抗氧化酶的诱导作用也可以被ZnPP所抑制,并可以被CO逆转。综上所述,AsA的细胞保护作用至少一部分是通过HO1诱导的抗氧化系统和降低Cd积累发挥的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物抗逆研究现状
• 1.1.1 常见非生物胁迫种类及对植物的影响
• 1.1.1.1 干旱胁迫
• 1.1.1.2 盐胁迫
• 1.1.1.3 低温胁迫
• 1.1.1.4 重金属胁迫
• 1.1.1.5 氧化胁迫
• 1.1.2 植物适应逆境胁迫的机制研究
• 1.1.2.1 植物对干旱胁迫的应答机制
• 1.1.2.2 植物对重金属胁迫的应答机制
• 1.1.3 结语
• 1.2 血红素加氧酶的研究进展
• 1.2.1 HO基因的克隆与蛋白结构
• 1.2.2 植物HO生理功能
• 1.2.3 结语
• 1.3 氢气生理功能的研究进展
• 1.3.1 氢气在动物体内的生理功能
• 1.3.2 氢气在植物中的生理功能
• 1.3.3 结语
• 1.4 抗坏血酸在植物中功能的研究进展
• 1.4.1 在植物生长和发育中的作用
• 1.4.2 酶的辅因子
• 1.4.3 植物的抗氧化能力
• 1.4.4 重金属的转移和去毒
• 1.4.5 在胁迫防御中的作用
• 1.4.6 结语
• 1.5 本研究的目的和意义
• 1.6 本研究的工作假说与技术路线
• 第二章 氢气增强紫花苜蓿非生物胁迫耐性的机理
• 摘要
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂
• 2含量的测定'>2.1.2 H₂含量的测定
• 2.1.3 富氢水（HRW）的制备
• 2.1.4 植物材料和生长条件
• 2.1.5 TBARS含量测定
• 2.1.6 组织化学染色
• 2.1.7 抗氧化酶活性测定
• 2.1.8 凝胶电泳
• 2.1.9 转录本测定
• 2.1.10 HO1蛋白印记分析
• 2.1.11 RWC
• 2.1.12 种子萌发实验和根生长测定
• 2.1.13 气孔孔径测量
• 2O₂信号'>2.1.14 使用荧光探针检测H₂O₂信号
• 2.1.15 质外体pH测定
• 2.1.16 统计分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 氢气诱导血红素加氧酶1缓解除草剂百草枯胁迫
• 2产生'>2.2.1.1 PQ抑制根生长并诱导H₂产生
• 2缓解PQ引起的根生长抑制'>2.2.1.2 H₂缓解PQ引起的根生长抑制
• 2保护紫花苜蓿抵御PQ引起的叶片脂质过氧化'>2.2.1.3 H₂保护紫花苜蓿抵御PQ引起的叶片脂质过氧化
• 2预处理降低叶片中O₂^-和H₂O₂含量'>2.2.1.4 H₂预处理降低叶片中O₂^-和H₂O₂含量
• 2.2.1.5 抗氧化酶的变化
• 2的保护作用可以被ZnPP削弱'>2.2.1.6 H₂的保护作用可以被ZnPP削弱
• 2预处理对HO1含量的诱导作用'>2.2.1.7 H₂预处理对HO1含量的诱导作用
• 2处理可以提高紫花苜蓿对干旱胁迫、盐胁迫和冷胁迫的耐性'>2.2.1.8 H₂处理可以提高紫花苜蓿对干旱胁迫、盐胁迫和冷胁迫的耐性
• 2.2.2 氢气通过调节叶片质外体pH正调控紫花苜蓿ABA依赖的干旱胁迫响应
• 2产生'>2.2.2.1 外源ABA和干旱胁迫处理可以诱导H₂产生
• 2可以增强紫花苜蓿对外源ABA的敏感性'>2.2.2.2 H₂可以增强紫花苜蓿对外源ABA的敏感性
• 2通过调节叶片质外体pH改变气孔对ABA的敏感性'>2.2.2.3 H₂通过调节叶片质外体pH改变气孔对ABA的敏感性
• 2增强紫花苜蓿对干旱胁迫的耐性'>2.2.2.4 H₂增强紫花苜蓿对干旱胁迫的耐性
• 2.3 讨论
• 2.3.1 氢气诱导血红素加氧酶1缓解除草剂百草枯胁迫
• 2.3.2 氢气通过调节叶片质外体pH正调控紫花苜蓿ABA依赖的干旱胁迫响应
• 第三章 抗坏血酸通过诱导血红素加氧酶1缓解镉胁迫
• 摘要
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 植物材料、培养条件和处理
• 3.1.3 TBARS含量测定
• 3.1.4 AsA含量测定
• 3.1.5 组织化学染色分析
• 3.1.6 镉含量测定
• 3.1.7 HO活性分析
• 3.1.8 转录本测定
• 3.1.9 统计分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 镉胁迫下紫花苜蓿组织内TBARS和AsA含量的变化
• 3.2.2 AsA或hemin可以缓解镉对紫花苜蓿幼苗造成的氧化伤害
• 3.2.3 AsA可以诱导HO1含量的上升
• 3.2.4 AsA的保护作用可以被HO1抑制剂ZnPP所抑制
• 3.2.5 抗氧化酶基因转录本的分析
• 3.3 讨论
• 全文讨论与结论
• 创新点及展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢