参附注射液对大鼠急性压力超负荷及乳鼠心肌细胞缺糖缺氧损伤的影响

论文摘要

目的：采用腹主动脉结扎的方法制作急性压力超负荷大鼠模型，研究参附注射液对其进行治疗后，以及参附注射液提前干预后大鼠急性压力超负荷在不同时间点的血流动力学及心肌组织病理学变化，观察参附注射液对急性压力超负荷大鼠心肌组织ANP表达水平，及对急性压力超负荷大鼠心肌组织Na+-K+ATPase与Ca2+-ATPase表达水平的影响，并对腹主动脉结扎致压力超负荷大鼠心肌细胞凋亡率及凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达的影响进行研究，同时采用体外培养心肌细胞的方法，并造成缺糖缺氧损伤模型，探讨参附注射液对急性压力超负荷大鼠的干预及治疗作用及缺糖缺氧损伤的心肌细胞的作用。方法：参照相关文献制作急性压力超负荷大鼠模型。实验分为：（1）药物治疗组：雄性Wistar大鼠50只，随机取8只作为假手术（Sham）组，其余42只行腹主动脉结扎术。其中10只大鼠于腹主动脉结扎术中死亡，32只存活大鼠随机分为模型组、参附组、西地兰组、多巴酚丁胺组，每组8只。假手术组仅分离腹主动脉而不结扎。术后2小时，分离大鼠左侧颈外静脉，分别推注①参附组：参附注射液0.5ml（人参皂甙3.5mg/1ml）；②西地兰组：西地兰0.5ml（0.036mg/1ml）；③多巴酚丁胺组：多巴酚丁胺0.5ml（1.8mg/1ml）。（2）药物提前干预组：65只雄性Wistar大鼠随机分为5组。假手术组，模型组、参附高剂量组、参附低剂量组及依那普利组，其中假手术组为5只大鼠，其余四组各15只大鼠。参附高剂量组与低剂量组大鼠分别以8ml/kg及4ml/kg腹腔注射参附注射液，同时以生理盐水10ml/kg灌服；依那普利组大鼠灌服依那普利溶液10ml/kg（0.5mg/ml），同时腹腔注射生理盐水（8ml/kg），每日一次，连用7日后行腹主动脉结扎术；假手术组同时进行腹腔注射（8ml/kg）及灌服生理盐水（10ml/kg），7日后作腹部正中切口2cm后钝性分离腹主动脉但不结扎腹主动脉。血流动力学参数（1）药物治疗组：术后2小时，插入左室导管，八道生理记录仪记录压力曲线，计算左室收缩功能参数：左室内压峰值（LVSP）、左室压力上升最大速度(+dp/dtmax)及左室舒张功能参数：左室舒张末内压（LVEDP）、左室压力下降最大速度(-dp/dtmax)。间隔5分钟后，分别按不同组别从静脉推注参附注射液、西地兰及多巴酚丁胺，间隔10分钟后再次记录参附组、西地兰组、多巴酚丁胺组大鼠的血流动力学参数。（2）药物干预组：腹主动脉结扎术后1/2小时、1小时及2小时，于模型组、参附高剂量组、参附低剂量组及依那普利组中分别取5只大鼠行血流动力学检测及其他指标检测，同时测定假手术组上述3个时段血流动力学参数及其他指标采用放射免疫（RIA）法检测心肌组织ANP表达，分光光度法测定心肌组织中Na+/K+ATPase,Ca2+-ATPase含量。具体操作步骤按说明书进行采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡，采用免疫组织化学染色检测心肌细胞Bcl-2与Bax蛋白。采用全自动图像分析仪于HPIAS-2000图像分析系统分析棕黄色阳性颗粒的平均吸光度（A）用2-3天Wistar乳鼠进行心肌细胞的分离、纯化、培养，实验时用缺糖Hanks液代替正常培养基。培养瓶内立即充入氮气（1升/分流量）30秒，造成缺糖缺氧心肌细胞损伤模型。对照组用正常培养基不含氮气取培养心肌细胞，随机分为：1组：正常对照组；2组：缺糖缺氧组；3组：缺糖缺氧+参附液高剂量组（含人参皂甙1000μg/ml）；4组：缺糖缺氧+参附液中剂量组（含人参皂甙500μg/ml）；5组：缺糖缺氧+参附液低剂量组（含人参皂甙250μg/ml）；6组：缺糖缺氧+依那普利组（500μg/ml），于倒置显微镜下观察心肌细胞生长情况和搏动频率，MTT比色法检测细胞活力，流式细胞仪检测心肌细胞DNA含量、细胞周期及凋亡率结果：在腹主动脉结扎后，大鼠出现呼吸浅而快，少动，唇舌紫绀等症状，符合中医心肾阳虚病机范畴，在结扎大鼠腹主动脉导致急性压力超负荷后，心率在参附组与西地兰组药物治疗后较治疗前显著降低（P＜0.01），而多巴酚丁胺组用药后HR显著增加（P＜0.01）；参附组、西地兰组、多巴酚丁胺组药物治疗后与治疗前相比，LVSP、+dp/dtmax在治疗后均有非常明显的升高（P＜0.01）；参附组药物治疗后-dp/dtmax较治疗前明显上升，而西地兰组和多巴胺组则显著下降（P＜0.01）；药物治疗后，参附组LVEDP有非常显著性的下降，而西地兰组与多巴酚丁胺组则明显上升（P＜0.01）。同时，提前使用参附注射液或依那普利大鼠各项血流动力学参数在急性压力超负荷后各时间点均出现非常明显的改变（P＜0.01）：在参附注射液提前干预组中，与模型组相比，高、低剂量组参附注射液各项血流动力学参数均有非常显著的差异（P＜0.01），其中提前使用参附低剂量组大鼠LVSP与-dp/dtmax较高剂量组明显降低（P＜0.05）；依那普利组大鼠LVSP及+dp/dtmax较参附组明显降低（P＜0.01）。实验中我们发现腹主动脉结扎后0.5小时、1小时、2小时，大鼠心肌组织ANP水平随时间逐渐升高，腹主动脉结扎2小时后大鼠心肌组织ANP水平较假手术组升高了5.45倍，而此时应用参附注射液即能有效地降低急性压力超负荷大鼠心肌组织ANP水平；同时，在结扎大鼠腹主动脉前使用参附注射液，无论高剂量或是低剂量，其均能有效地降低腹主动脉结扎后大鼠心肌组织ANP水平，显示在急性压力超负荷时心房ANP分泌增加，而参附注射液有减少其分泌的作用，且疗效较西地兰和多巴酚丁胺为佳，提示参附注射液对急性压力超负荷状态下的心脏ANP表达具有良好的早期干预作用。同时我们发现急性压力超负荷大鼠在腹主动脉结扎后0.5小时，心肌组织Na+/K+ATPase表达水平较假手术组有显著性的升高，但在随后的时间点（1小时和2小时），模型组大鼠心肌组织Na+/K+ATPase表达水平较假手术组有非常显著性的降低（P＜0.01），且心肌组织Na+/K+ATPase表达水平随时间的推移有降低的趋势，腹主动脉结扎2小时后，大鼠心肌组织Na+/K+ATPase与Ca2+-ATPase表达水平均较假手术组有非常显著性的降低（P＜0.01），同时，我们在实验中亦发现，Na+/K+ATPase与Ca2+-ATPase表达水平与心肌组织ANP蛋白表达水平呈负相关。实验结果显示，参附注射液、西地兰及多巴酚丁胺均能有效地增加大鼠心肌组织Na+-K+ATPase表达水平以及Ca2+ATPase表达水平；而提前使用参附注射液干预后，与不同时间点模型组大鼠心肌组织Na+-K+ATPase表达水平相比，高、低剂量参附注射液及依那普利均能显著增加Na+/K+ATPase及Ca2+ATPase表达水平。实验中我们发现在腹主动脉结扎后0.5小时，1小时和2小时，模型组大鼠心肌细胞凋亡率较假手术组明显升高，腹主动脉结扎后2小时模型组大鼠心肌细胞凋亡率较假手术组升高9.13倍，且急性压力超负荷大鼠心肌细胞凋亡率随着时间的推移有上升趋势。而预先使用高、低剂量参附注射液及依拉普利均能明显降低腹主动脉结扎后在不同的时间点的大鼠心肌细胞凋亡率，同时在腹主动脉结扎后2小时使用参附注射液能降低大鼠心肌细胞凋亡率。我们在实验中采用流式细胞术对使用不同剂量参附注射液缺糖缺氧培养的心肌细胞的细胞周期及心肌细胞凋亡率进行了监测。结果显示，在培养的正常心肌细胞在空白对照组心肌细胞G1期之前，存在亚二倍体峰，提示处于正常条件培养的乳鼠心肌细胞即有细胞凋亡的存在，凋亡率为（1.08±0.84）％；参附注射液高剂量组+缺糖缺氧培养3小时后心肌细胞凋亡率为（2.23±0.89）％，与正常对照组相比无显著性差异。参附注射液中与低剂量组+缺糖缺氧培养3小时后心肌细胞凋亡率为分别为（4.30±0.47）％与（5.7±0.56）％，二组心肌细胞凋亡率与对照组相比有显著性差异（p＜0.05），依那普利+缺糖缺氧培养3小时后心肌细胞凋亡率为（11.23±0.34）％，与缺糖缺氧相比有显著性差异（p＜0.05），不同浓度的参附注射液与依那普利相比，亦有显著性的差异（p＜0.05）。本实验结果显示：缺糖缺氧培养3小时后，与正常对照组ANP表达量相比，缺糖缺氧组ANP表达明显增高（P＜0.01）。参附注射液干预后能明显降低缺糖缺氧诱导心肌细胞ANP的合成（P＜0.01），依那普利亦能明显降低缺糖缺氧诱导心肌细胞ANP的合成（P＜0.05），但与不同浓度的参附注射液相比，仍有显著性的差异（P＜0.05）。结论：总结以上实验结果，我们认为急性压力超负荷导致心肌射血时阻力增加，心脏做功增加的同时出现结构性的变化，以适应这种后负荷的改变，即心肌重塑，在此过程中心肌的耗氧耗能急剧增加。但机体储备有限，因此心肌细胞供氧供能相对不足，结果引起机体神经内分泌的激活如ANP表达增多，细胞因子分泌增多，进一步引起心肌细胞的重塑，最终形成心室扩张，肥厚；另一方面压力牵张可直接导致心肌细胞的结构及功能改变，引起相关基因的表达异常，Na+-K+-ATP酶、Ca++-ATP酶表达的异常，并引发心肌细胞离子流障碍，同时由于能量及氧代谢异常可引起心肌细胞凋亡，心肌细胞数目减少，这些因素共同形成心脏舒缩功能障碍，心功能衰竭，临床上出现心慌、气喘、乏力、肢冷、水肿等症状，这些与中医之心气不足、心肾阳虚证候极为相似，故推测作为心衰根本病因的心肾阳虚之生物学基础可能在于心肌能量与氧代谢障碍。因此参附注射液益气温阳作用机制可能在于改善了急性压力超负荷状态下心肌异常的能量及氧代谢，减少了心肌ANP表达，有效提高心肌细胞的Na+/K+ATPase及Ca2+ATPase的表达水平，改善急性压力超负荷状态下心肌细胞异常的Ca2+摄取和释放，有效的预防和治疗急性压力超负荷状态下和缺糖缺氧条件下培养心肌细胞凋亡的发生，减少心肌细胞数量的丧失，从而改善心力衰竭时心脏收缩力减弱和舒张异常延迟的状态，维持心脏的功能。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 前言
• 第一部分 参附注射液对急性压力超负荷大鼠的影响
• 实验一:参附注射液对急性压力超负荷大鼠血流动力学的影响
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 实验二:参附注射液对急性压力超负荷大鼠心肌组织心房利钠肽表达水平的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• +-K⁺ATPase与Ca²⁺-ATPase表达水平的影响'>实验三:参附注射液对急性压力超负荷大鼠心肌组织Na⁺-K⁺ATPase与Ca²⁺-ATPase表达水平的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 实验四:参附注射液对急性压力超负荷大鼠心肌组织细胞凋亡及凋亡相关蛋白BCL-2 BAX蛋白表达水平的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 参附注射液对体外培养缺糖缺氧损伤乳鼠心肌细胞的影响
• 参附注射液对体外培养缺糖缺氧损伤心肌细胞的影响
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 综述一:参附注射液治疗心血管疾病的实验研究进展
• 综述二:中医中药与心肌细胞培养
• 附图
• 博士在读期间发表的论著论文
• 致谢