论文摘要
虽然通过核移植技术,很多哺乳动物被克隆成功,但核移植的总体效率低于5%。而且传统核移植操作程序复杂,对设备和技术要求较高,阻碍了该技术的广泛应用。诱导去核（induced enucleation,IE）对卵母细胞损伤小,去除较少的胞质量和蛋白、分子成分就可以达到去核目的。但是DC诱导去核的胞质被预先激活,用作受体时已经达到末期（TII phase）,然而MII去核卵母细胞被公认为是最好的受体,而且核移植之后的延期激活对供体核的重编是非常重要的,从而导致诱导去核的受体胞质支持重构胚发育的能力较低,限制了诱导去核方法在体细胞核移植技术上的应用。本研究尝试通过反向核移植技术（reverse-order nuclear transfer, RNT）与诱导去核法相结合,探索一种最优化的诱导去核反向核移植操作程序（IRNT）。因此,本研究以ICR小鼠卵母细胞为材料,进行了如下实验:1.实验对比了透明带磨口刺入和透明带直接刺入两种去核方法、蔗糖处理、细胞松弛素B（CB）浓度及去核针内径对小鼠卵母细胞去核效率的影响,及CB浓度对去除部分胞质的孤雌胚早期发育的影响。结果显示:（1）添加3%蔗糖与对照组之间的去核效率无影响（P>0.05）;（2）CB浓度为5、10和20μg/mL时,磨口法的去核成功率差异不显著（P>0.05）,刺入法在CB浓度为5和10μg/mL时去核成功率显著高于20μg/mL组（P<0.05）,磨口法去核成功率显著高于刺入法（P<0.05）;（3）去除部分胞质的孤雌胚卵裂率各实验组之间差异不显著（P>0.05）,20μg/mL CB处理组囊胚率显著低于其它处理组（P<0.05）;（4）在去核针内径为10、15和20μm时,磨口法去核成功率差异不显著（P>0.05）,刺入法应用20μm去核针的去核成功率显著低于其它组（P<0.05）。结果表明,磨口法在10μg/mL CB和15μm内径去核针条件下提高了去核效率（成功率为90.8%,速度为50 s/个）,且不影响孤雌胚的体外发育率。2.比较了乙醇、SrCl2两种激活方法和卵龄对脱羰秋水仙碱（ Demecolcine , DC）诱导去核率和孤雌激活第二极体排除率的影响。结果显示,注射hCG后不同时间采集的卵母细胞,无论是乙醇还是SrCl2激活处理后的IE率随卵龄的增加先显著升高,后又降低,注射hCG后20～21 h采集的卵母细胞IE率显著高于其它组（p<0.01）;注射hCG后相同时间采集的卵母细胞,乙醇和SrCl2激活处理后的IE率差异不显著（p>0.05）;随卵龄的增加卵母细胞第二极体排出率有先升高后降低的趋势,在注射hCG后20～21 h采集卵母细胞第二极体排出率达到最高,且第二极体排出率显著高DC处理组,说明DC处理对第二极体排出有抑制作用。结果表明,SrCl2在小鼠卵母细胞诱导去核中的作用效果与乙醇相同,注射hCG后20～21 h采集的卵母细胞的IE率较高（乙醇为62.6%;SrCl2为56.8%）。3.本研究优化了IRNT中DC的作用起始时间和持续时间,并比较了诱导去核反向核移植、诱导去核正向核移植和传统显微操作核移植方法对重构胚发育能力的影响。结果显示,电融合后用DC处理与乙醇激活后用DC处理的反向核移植成功率差异不显著（p>0.05）;反向核移植成功率在乙醇激活后处理60 min时显著高于处理40 min组（p<0.01）,与处理90和120 min组差异不显著（p>0.05）,但随处理时间延长有下降趋势,处理90 min后,③的比例不再变化,④的比例显著增加（p<0.01）,供体核有可能被排出胞外,导致反向核移植成功率降低;三种核移植方法的重构胚构建率差异极显著（p<0.01）,传统核移植方法构建率最高,卵裂率各组之间差异不显著,囊胚率反向核移植极显著高于诱导去核正向核移植（p<0.01）,显著高于传统核移植方法（p<0.05）。结果说明,电融合后用DC处理到乙醇激活后60 min反向核移植成功率达到最高,反向核移植重构胚囊胚发育率较高,但重构胚的构建率不及传统核移植方法。