蜜环菌催眠功能优良菌株筛选和发酵工艺优化研究

论文题目: 蜜环菌催眠功能优良菌株筛选和发酵工艺优化研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物栽培学与耕作学

作者: 刘景圣

导师: 李玉

关键词: 蜜环菌,催眠,菌株筛选,有效部位,工艺优化

文献来源: 吉林农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 蜜环菌(Armillaria spp.)属于担子菌门、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属。在世界各大洲均有分布，在我国主要分布在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等省区。蜜环菌是与传统中草药天麻(Gastrodia elata Blume)共生的著名食药兼用的真菌。多年来，经大量的试验研究表明，蜜环菌的菌丝体和发酵液均具有较强的催眠、抗惊厥、抗缺氧等神经调节功能和脑保护功能，还具有增加心、脑血管血流量，增强机体免疫调节功能等生理活性。尤其是在催眠、抗惊厥、抗缺氧和调节心、脑血管功能等方面具有与天麻相同的药理活性。因此，20世纪70年代开始，在对蜜环茵生理活性和化学成分研究，以及蜜环菌的深层发酵工艺和系列制剂的开发等方面引起了中国和世界许多国家的重视，取得了大量研究成果，开发生产出多种蜜环菌制剂。蜜环菌中含有丰富的化学成分，通过对蜜环菌菌丝体和发酵液的化学成分的系统研究，分离得到了蜜环菌多糖、蜜环菌素等倍半萜类化合物和嘌呤类化合物等多种生理活性物质，并对这些化合物的理化特性和生物学活性进行了较细致的研究。由于野生天麻在我国的资源有限，栽培天麻虽已获得成功，但因受到各种条件影响，其生长周期长，并且必须有蜜环菌作为萌发菌和营养供体，技术要求严格，生产成本高，价格贵，难以满足人们保健和临床用药的需求。以蜜环菌及其发酵产物替代天麻，来解决天麻供应不足，保护野生天麻资源等问题，是一条行之有效的资源开发新途径。多年来，经过科研工作者和医药生产企业的不懈努力，脑心舒口服液、蜜环菌片、蜜环菌糖浆等蜜环菌制剂，在调节睡眠和心、脑血管功能等方面收到了较好疗效。据不完全统计，目前在我国，仅脑心舒口服液的年产值就超过了6亿元以上。但是，脑心舒口服液等蜜环菌制剂的生产，主要以蜜环菌的菌丝体和发酵液为主要原料，没有明确有效部位和活性成分，只能属于三类药物。而且，用于发酵生产的蜜环菌菌种(菌株)还不统一，发酵工艺技术与控制不规范，发酵产物的产量不高，对蜜环菌发酵产物及其制剂的质量监测指标不明确。这些不利因素，影响了蜜环菌及其制剂的生产开发和质量、药效以及产品层次的进一步提高。本研究是作者主持的吉林省2001年科技发展计划项目“蜜环菌深层发酵工艺及其功能性食品研究”课题的重要组成部分。其主要内容和攻关目标是从长白山野生蜜环菌菌中分离生长性状良好的菌株，通过液体深层发酵特性和动物试验筛选具有催眠功能的优良蜜环菌菌株。在最适的培养基和摇床液体培养条件下扩大培养，将发酵产物利用分离提取等技术手段和动物试验进行有效部位活性跟踪试验，进一步明确蜜环菌发酵产物中催眠功能的有效部位，并以此有效部位的得率为主要指标，进一步优化蜜环菌液体深层发酵的生产工艺，以实现催眠功能提取部位有效得率的最大化。本研究的试验结果和研究结论包括以下几方面：1．从长白山不同地区采集到的天麻和蜜环菌的子实体中分离得到了16个蜜环菌菌株，分别为Ar-02，Ar-03，Ar-04，Ar-07，Ar-08，Ar-09，Ar-11，Ar-13，Ar-16，Ar-17，Ar-20，Ar-21，Ar-25，Ar-26，Ar-29，Ar-31。以目前“脑心舒”口服液生产所用的蜜环菌菌株(Ar-00)为对照，通过固体培养和液体培养，开展了各菌株的菌丝和菌索萌发时间及其形态特征、荧光特性、液体培养时菌丝球的形态、大小，发酵液色泽，荧光强度，产物的生物量等方面的试验研究。以各菌株的生长特性和生物量为主要指标，进一步筛选出生长性状良好的8个菌株Ar-02，Ar-03，Ar-07，Ar-08，Ar-09，Ar-11，Ar-13，Ar-31。2．经液体深层发酵试验研究，确定了8个生长性状良好的蜜环菌菌株各自的最适培养条件，在此基础上，对8个菌株进行了液体扩大培养，以“脑心舒”口服液生产菌株Ar-00为阳性对照菌株，将发酵产物(菌丝体和发酵液)进行催眠功能的动物试验，最终筛选出液体发酵生物量最高，催眠功能明显的优良菌株Ar-07。本研究还对Ar-07菌株进行了分子生物学鉴定，最终将Ar-07菌株确定为奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae Romagn)。通过单因素和正交试验，筛选确定了Ar-07菌株液体深层发酵的最适培养基和摇床扩大培养时的最适初始pH值、装液量、接种方法(菌丝球的破碎均质处理)和接种量、培养温度、摇床转速、乙醇添加量和最佳发酵时间。3．对Ar-07菌株的液体深层发酵产物(发酵液)进行有效部位的多层次分离、提取，并通过催眠功能的动物试验跟踪，确定了Ar-07菌株发酵液中具有明显催眠功能的有效部位。4．以发酵液中的催眠功能有效部位得率为主要指标，通过正交试验和发酵动力学研究，进一步优化了蜜环菌液体深层发酵的生产工艺，并与蜜环菌的普通发酵工艺相比较，开展了较大规模的中试研究。发酵产物中的菌丝体产量比普通发酵法提高了18.30％，发酵液中催眠功能有效部位得率比普通发酵法提高了21.64％。通过对中试结果分析检测和动物试验证明，本研究所确定的优化工艺是合理可靠的。作者首次从野生蜜环菌的采集、菌种分离、催眠活性菌株的优选、有效部位的确定到液体深层发酵工艺的优化，展开了全面、系统的研究工作。本论文具有以下创新点：1．通过大量的试验研究最终筛选出的蜜环菌Ar-07菌株为生长性状好、生物量高、活性明显、功效稳定的优良菌株，并利用分子生物学鉴定方法将该菌株确定为奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae Romagn)。可为蜜环菌制剂的开发生产提供稳定、可靠的优良菌种。2．通过对蜜环菌Ar-07菌株液体深层发酵产物的多层次分步提取和催眠功能动物试验跟踪，筛选确定了功能活性明显的有效部位，为蜜环菌深层发酵工艺的进一步优化，发酵产物的质量监控提供了可靠依据，为蜜环菌制剂的二次开发奠定了良好基础。3．以催眠活性有效部位的得率为主要指标，进一步优化了蜜环菌液体深层发酵的工艺条件和控制参数，并与普通发酵工艺相比较开展了中试生产研究。结果表明，采用优化工艺进行发酵与普通发酵工艺相比，菌丝体的生物量提高了18.30％，发酵液中有效部位的得率提高了21.64％。此项研究成果为今后蜜环菌液体深层发酵生产及其系列制剂的生产开发提供了可靠的工艺技术。4．本试验确定的破碎匀质接种法经蜜环菌中试生产验证可以提高发酵产物生物量，大量节省菌种的投放量(节省40％)。该法具有明显的创新性，经进一步完善后可以在食药用真菌的液体深层发酵生产中推广应用。本研究所取得的创新性成果为蜜环菌的发酵特性、发酵产物的化学成分分析和活性单体的提取分离研究以及蜜环菌系列产品的深层次开发利用研究奠定了一定基础，可以为蜜环菌液体深层发酵和系列产品的生产开发提供优良菌株和科学合理的工艺技术，对蜜环菌的标准化发酵生产和工艺质量监控具有良好的指导作用。在提高蜜环菌制剂质量和功效的稳定性，加快“脑心舒”口服液的二次开发和蜜环菌创新性药物的研究以及蜜环菌第三代功能性食品的研究与开发，促进食药用菌的产业化发展等方面具有良好的应用价值和现实意义。

论文目录:

摘要

英文摘要

第一章前言

1 研究背景

2 蜜环菌及其制剂的国内外研究现状

2.1 蜜环菌生物学特性研究

2.2 蜜环菌的培养特性研究

2.3 蜜环菌的化学成分研究

2.4 蜜环菌的功能活性研究

2.5 睡眠调节的研究现状

2.6 蜜环菌深层发酵研究

2.7 蜜环菌制剂开发应用现状和研究开发方向

3 研究的目的、意义及内容

3.1 研究的目的和意义

3.2 研究的主要内容

第二章蜜环菌的分离及催眠功能优良菌株的筛选

1 试验材料

1.1 菌种来源

1.2 试验原材料

1.3 化学试剂

1.4 主要仪器设备

1.5 培养基

1.6 试验动物

2 方法

2.1 菌种分离

2.1.1 从天麻组织中分离菌株

2.1.2 从蜜环菌子实体中分离菌株

2.2 菌种鉴定

2.3 生长性状良好菌株的筛选

2.3.1 固体培养生长特性研究

2.3.2 液体培养生长特性研究

2.3.3 良好菌株的确定

2.4 各菌株培养条件的研究

2.4.1 培养温度对各菌株生长特性的影响

2.4.2 初始pH值对各菌株生长特性的影响

2.4.3 摇床转速对各菌株生长特性的影响

2.4.4 乙醇添加量对各菌株生长特性的影响

2.5 催眠功能优良菌株的筛选

2.5.1 催眠功能菌株的初步筛选

2.5.2 催眠功能优良菌株的确定

2.6 优良菌株的分子生物学鉴定

2.6.1 基因组DNA提取

2.6.2 PCR扩增

2.6.3 PCR扩增产物的克隆

2.6.4 PCR克隆产物的序列测定

2.6.5 Ar-07菌株的分子生物学鉴定

3 结果与讨论

3.1 菌种分离与鉴定结果

3.2 生长性状良好菌株的筛选

3.2.1 各菌株的固体培养生长特性

3.2.2 各菌株的液体培养生长特性

3.2.3 菌株的筛选结果

3.3 各菌株培养条件的筛选

3.3.2 初始pH值对各菌株生长特性的影响

3.3.3 摇床转速对各菌株生长特性的影响

3.3.4 乙醇添加量对各菌株生长特性的影响

3.4 催眠功能优良菌株的筛选结果

3.4.1 催眠功能菌株的初步筛选结果

3.4.2 催眠功能优良菌株的确定

3.5 AR-07菌株的分子生物学鉴定结果

3.5.1 基因组DNA的提取

3.5.2 PCR扩增结果

3.5.3 PCR产物的克隆

3.5.4 Ar-07菌株ITS区DNA序列测定与分析

3.5.5 Ar-07菌株的鉴定结果

第三章 AR-07菌株摇床液体培养与催眠功能有效部位的研究

1 试验材料

1.1 主要仪器

1.2 化学试剂与原材料

1.3 菌种

1.4 培养基

1.5 试验动物

1.6 阳性对照药

2 方法

2.1 最适液体发酵培养基的优化

2.1.1 液体培养基中最适碳源筛选试验

2.1.2 液体培养基中最适氮源筛选试验

2.1.3 液体培养基优化正交试验

2.2 摇床液体培养条件的研究

2.2.1 菌丝球破碎匀质接种法及接种量对生物量的影响

2.2.2 培养条件对生物量的影响

2.2.3 添加乙醇对生物量的影响

2.3 蜜环菌催眠功能有效部位的研究

2.3.1 发酵液第一步提取与活性跟踪试验

2.3.2 发酵液第二步提取与活性跟踪试验

2.3.3 发酵液第三步提取与活性跟踪试验

2.3.4 催眠功能试验

3 结果与讨论

3.1 最适液体发酵培养基的优化试验结果

3.1.1 液体培养基中最适碳源的筛选结果

3.1.2 液体培养基中最适氮源的筛选结果

3.1.3 液体培养基优化结果

3.2 摇床液体培养条件的研究结果

3.2.1 菌丝球破碎匀质接种法及接种量对生物量的影响结果

3.2.2 培养条件对生物量的影响结果

3.2.3 乙醇添加量对生物量的影响

3.2.4 培养基与培养条件优化结果

3.3 蜜环菌催眠功能有效部位的研究结果

3.3.1 发酵液第一步提取与活性跟踪试验结果

3.3.2 发酵液第二步提取与活性跟踪试验结果

3.3.3 发酵液第三步提取与活性跟踪试验结果

第四章蜜环菌AR-07菌株液体深层发酵工艺优化的研究

1 试验材料

1.1 主要仪器

1.2 化学试剂

1.3 试验原材料

1.4 菌种

1.5 中试生产发酵培养基

1.6 试验动物

1.7 阳性对照药

2 方法

2.1 液体深层发酵生产工艺优化

2.2 发酵动力学研究

2.3 液体深层发酵中试生产研究

2.3.1 优化工艺中试生产工艺流程

2.3.2 普通工艺中试生产工艺流程

2.4 动物试验方法

3 结果与讨论

3.1 液体深层发酵生产工艺优化试验结果

3.2 液体深层发酵动力学研究

3.2.1 发酵过程中菌丝形态特征及发酵液状态观察

3.2.2 发酵动力学研究

3.2.3 发酵终点的判定

3.3 液体深层发酵中试生产研究

3.4 动物试验验证结果

3.5 优化工艺及其参数的确定

第五章讨论

1 关于菌株的筛选和优良菌株的确定

2 关于培养基的优化研究

3 关于发酵液中有效部位的提取分离

4 关于工艺优化和中试生产试验研究

5 今后应开展的研究工作

第六章结论

参考文献

致谢

发布时间: 2007-11-23

参考文献

[1].蜜环菌和猪苓的发育学及其二者的相互作用机理[D]. 郭顺星.中国协和医科大学1995

蜜环菌催眠功能优良菌株筛选和发酵工艺优化研究

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