一、实验动物在生物技术药物生产中的应用(论文文献综述)
周青青,张琼谊,余桂媛,闫昌誉,黄蓉萍,韩绍聪,李怡芳,李维熙,何蓉蓉,栗原博[1](2021)在《鸡胚模型在生物活性评价中的应用》文中提出实验动物模型在生物活性筛选及安全性评价等方面发挥着重要的作用,但由于传统的哺乳类动物实验模型难以进行快速的活性评价,而细胞等体外实验方法也具有一定的局限性。因此,线虫、果蝇及斑马鱼等模式动物已被广泛使用。其中,与传统的实验动物模型相比,鸡胚模型具有操作简便、取材容易、实验成本低及实验周期短等特点。此外,由于鸡胚发育过程清晰、易于观察及孵育期间不受母体代谢的影响,因此有利于直接评价生物活性及对不同发育阶段的作用。基于上述理由,本文对鸡胚模型在生物活性评价中的应用进行综述,旨在为该实验模型的应用提供有益的参考。
袁野[2](2021)在《荧光聚合物点的细胞内吞定量及活体内细胞追踪研究》文中认为随着纳米药物的问世以及人们对各类细胞性能逐步清晰的认知,基于细胞的治疗与药物传递体系逐渐被开发利用,由于其生物相容性高、半衰期长、靶向效果明显、毒副作用低等良好的药代动力学特性被视为是实现未来医学突破的重要手段,在生物医学领域得到了广泛的关注。其中的一些细胞体系甚至已经在某些临床试验中取得了阶段性的成功,比如红细胞能够大幅度延长药物的循环寿命;淋巴细胞能够有效提高药物的靶向安全性;干细胞能够对受损组织进行再生修复等等。虽然这项技术有着美好的未来,但如何对被载药物进行实时地、精准地定量与调控,怎样能明确地获悉细胞在宿主体内完整的代谢过程都是阻碍其在临床上实现系统性应用的关键因素,这些问题都急需我们采用一些分子影像技术进行分析。生物荧光技术以其分辨率高、无电离辐射、操作简易、可多通路复用等优势在分子检测、细胞标记、活体成像等生物应用中优势明显,而这些性能的保证都紧紧依赖于荧光探针的选择和开发。在传统的荧光探针中,有机小分子染料吸收截面小、光稳定性差不利于长期监测,荧光蛋白又存在基因转染带来的潜在风险。而在新型的纳米荧光探针中,无机量子点的重金属毒性、上转换材料的低荧光量子效率以及碳点的弱组织穿透能力等问题都有待解决。聚合物点(Pdots)以其吸收截面大、荧光量子效率高、辐射跃迁速率快、稳定性高、生物相容性好以及表面易功能化等特性在生物传感、活体成像以及光治疗等方面应用广泛,是基于细胞的治疗与传递体系中完美的纳米药物及检测试剂。针对基于细胞的治疗与药物传递体系中被载药物的实时定量以及载体细胞在宿主体内的分布监测这两个问题,本文主要取得了如下研究成果:(1)对细胞内吞的聚合物点实现了荧光定量并将定量结果用于生物成像及光动力治疗应用。我们通过与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的量化结果进行对比,发现以荧光光谱、荧光显微镜以及流式细胞术中获取的荧光信号对细胞内的聚合物点进行定量也能得到相同的结果,即按照我们的标记手法,每个乳腺癌细胞(MCF-7)大致可以内吞1.3×106个直径约为20 nm的聚合物点,并通过亮度对比,我们可以清楚地获得任意特定细胞的内吞数量。另外,我们可以通过改变标记时间的长度对细胞内吞聚合物点的数量进行调控,并利用聚合物点的光动力特性,获取了在特定光能量密度下,光敏剂聚合物点PFBT@Pt对肿瘤细胞MCF-7的半抑制浓度(IC50)。(2)利用掺杂型近红外荧光聚合物点实现了对活体内细胞追踪的三维成像。我们通过将深红光激发聚合物和近红外荧光染料进行掺杂,利用二者之间的F(?)rster共振能量传递,制备出在670 nm处有强吸收、在775 nm处有强荧光,量子效率约为20%的适用于活体成像的近红外聚合物点NIR1,并通过细胞穿膜肽Tat的介导使聚合物点对细胞的标记效率提升了两个数量级。在后续的活体实验中,我们从二维成像和三维成像两种模式采集的图像中均观察到被移植细胞的荧光强度有明显地从肺部向肝部的迁移。(3)设计制备了混杂型近红外聚合物点并利用其观察干细胞与癌细胞在体内的分布差异。我们通过将深红光激发聚合物和近红外荧光聚合物进行掺杂,利用二者之间的F(?)rster共振能量传递,制备出在670 nm处有强吸收、在800 nm处有强荧光,量子效率约为22%的适用于活体成像的混杂型近红外聚合物点NIR2,较于聚合物点NIR1,聚合物点NIR2不仅光谱更红、量子效率更高,同时也避免了染料泄露和聚集的风险。在将细胞穿膜肽Tat介导标记的细胞尾静脉移植入小鼠体内后,我们明显观察到干细胞与癌细胞在活体内的分布差异,通过进一步内脏及冰冻切片的荧光检测,可以细致地分析出干细胞与癌细胞在活体内不同的代谢轨迹。
寇瑶[3](2021)在《3nm氧化铁纳米颗粒对斑马鱼胚胎发育的毒性作用机制的研究》文中研究说明氧化铁纳米颗粒(ferric oxide nanoparticles,FeNPs)在生物医药领域具有广阔的应用前景,可作为药物载体、分子探针和造影剂等参与疾病治疗和临床诊断。亚五FeNPs是指粒径小于5 nm的FeNPs,特点是超小尺寸、分布窄、生物相容性好并具有超顺磁性,有广阔的应用潜力:可作为T1造影剂,提供高灵敏度肿瘤成像;在外部磁场的作用下,可靶向肿瘤组织,进行磁热治疗;也可用于细胞磁标记示踪与多模态分子影像探针构建等,且由于超小粒径的尺寸效应,可快速被肾脏和肝脏清除。为推进亚五氧化铁纳米颗粒的实际应用,我们以模式动物斑马鱼的胚胎作为研究对象,探讨了其对胚胎的发育毒性作用,对其进行生物安全评估。斑马鱼是进行脊椎动物研究的模式生物,其透明的胚胎和体外受精的受精方式对发育生物学的研究性实验提供了极大的便利,近年来荧光蛋白特异性标记的转基因斑马鱼品系的构建,进一步增强了斑马鱼作为模式生物的优势。我们以不同尺寸的6 nm和12 nm FeNPs作为参照,以斑马鱼胚胎作为研究对象,探讨了超小尺寸的3 nm FeNPs的发育毒性,主要结论如下:1、3 nm FeNPs对斑马鱼胚胎活力的影响:(1)斑马鱼胚胎死亡率随着FeNPs浓度增大,作用时间增长而增加;(2)斑马鱼胚胎的死亡率与FeNPs粒径成反比,即;(3)斑马鱼胚胎总畸形率随FeNPs浓度升高而增加,随粒径减小而增加,畸形具体表现为小头畸形、小眼畸形、心包水肿、卵黄囊肿、脊椎弯曲、尾部发育异常和发育迟缓甚至发育失败;(4)3 nm FeNPs对斑马鱼胚胎具有氧化损伤作用;(5)3 nm FeNPs可介导胚胎细胞的凋亡,其主要的作用部位为消化系统。2、3 nm FeNPs对斑马鱼胚胎器官发育的影响:(1)FeNPs对心脏发育的影响:以心脏转基因荧光斑马鱼Tg(cmlc2:EGFP)作为对象,3 nm FeNPs对心脏的毒性作用表现在使心脏发育迟缓,心脏体积较小,心室肥大;(2)FeNPs对血管发育的影响:以血管转基因荧光斑马鱼Tg(flk1:EGFP)作为对象,3 nm FeNPs对血管的毒性作用表现在血管发育不全,脑部血管收缩,尾部静脉血管分布异常,躯干节间血管闭塞,主动脉总体收缩等血液循环系统发育异常;(3)FeNPs对肝脏发育的影响:以肝脏转基因荧光斑马鱼Tg(lfabp:m Cherry)作为对象,FeNPs暴露后的胚胎肝脏体积明显减小;(4)FeNPs对肾脏发育的影响:以肾脏转基因荧光斑马鱼Tg(wt1b:EGFP)作为对象,FeNPs暴露2 dpf后发现FeNPs对肾脏的发育毒性具体表现为前肾肾小球缩小,肾小管颈部位明显缺失,肾小管近曲小管曲状折叠消失等肾脏发育畸形;(5)FeNPs对软骨发育的影响:3 nm FeNPs暴露后的幼鱼的头部骨骼变小,舌骨小角角度呈现弧形,梅克尔骨变短,角腮骨形态紊乱,咽尺等发育不明显,胸鳍发育缺陷。3、3 nm FeNPs对斑马鱼神经肌肉和运动系统发育的影响:(1)FeNPs对神经发育的影响:以Tg(eef1a1l1:EGFP)转基因荧光鱼作为对象,发现中枢神经系统和周围神经系统明显萎缩,神经系统发育出现异常;(2)FeNPs对骨骼肌发育的影响:使用偏振光检测胚胎骨骼肌发育,发现3 nm处理组肌肉组织呈现双折射平均强度仅为对照组的42%,骨骼肌发育不全,肌纤维束紊乱;(3)斑马鱼胚胎的运动轨迹分析:在明暗交替环境下的自由游泳实验中,发现3 nm FeNPs处理的斑马鱼幼鱼的运动能力下降,游泳距离相对于对照组下降了65%,移动速度减少了82%。4、为研究3 nm FeNPs对斑马鱼胚胎发育不同阶段发育毒性的分子机制,我们收集了终浓度40 mg/L 3 nm FeNPs处理的48 hpf、72 hpf、96 hpf和120 hpf的胚胎,对其进行转录组测序并分析,得到如下结果:(1)48 hpf组的胚胎眼部和感知系统的发育信号受到纳米颗粒的显着作用,并且对心脏和血管发育也有影响;(2)72 hpf组的表达差异基因集中在眼部发育和对光照的感知方面,包括神经突触、光刺激的感知、突触信号、光转导、视黄醇代谢等;(3)96 hpf时,处理组斑马鱼胚胎表达差异基因集中于感官知觉、光刺激的感知、凋亡、溶酶体、吞噬体、铁凋亡等;(4)120 hpf处理组的表达差异基因集中于铁稳态、三价铁结合、铁凋亡、细胞坏死、谷胱甘肽代谢等。5、转录组数据的加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)对上述3 nm FeNPs处理的48 hpf、72 hpf、96 hpf和120 hpf的胚胎的转录组数据进一步挖掘,筛选出关键基因:plcd1a和prkcdb。plcd1a与神经信号传导、神经传递激素、神经肌肉信号相关,影响GTPase蛋白偶联Wnt/Ca2+信号转导,从而作用于神经肌肉系统的信号传递,这与我们使用转基因荧光鱼所发现的表型一致,即3 nm FeNPs影响了胚胎的神经肌肉系统发育和运动能力;prkcdb表达量的升高会造成下游erk升高,导致ROS升高,细胞内过氧化产生,与前文结论一致,即3 nm FeNPs对胚胎活性的影响表现在对细胞的氧化胁迫和炎性反应。综上所述,本文系统研究了3 nm FeNPs的发育毒性及其作用机理,发现3 nm FeNPs对斑马鱼胚胎的胚胎活性、心脏发育、血管发育、肝脏发育、肾脏发育、软骨发育、神经肌肉系统和运动能力都有影响,并在转录组水平上探讨了3 nm FeNPs对斑马鱼胚胎的器官发育的分子机制。本研究对亚五氧化铁纳米颗粒的脊椎动物体内毒理学研究奠定了基础,以期推动临床研究的进行。
蔡雯雯[4](2021)在《近红外二区荧光染料标记黑色素纳米探针的构建及其应用研究》文中提出目的:NIR-Ⅱ FI(1000-1700 nm)能够提供更深的组织穿透能力(?10 mm),更高的信噪比和更好的时空分辨率。光声成像是近年来一种新兴的无创成像手段,整合了传统光学成像卓越对比度和超声成像高时空分辨率的优势。NIR-Ⅱ FI和PAI相结合为开发用于临床疾病成像、靶向治疗、疗效评估以及预后监测等的多模态探针提供了新策略。黑色素是一种广泛存在于人体的内源性色素,具有生物相容性好、可降解、化学结构易于修饰、光保护作用、金属离子螯和能力以及抗氧化等特性,因此广泛应用于包括生物成像、光热治疗、生物传感、诊疗一体化、抗感染和组织工程等生物医学领域中。本研究的目的是利用NIR-Ⅱ小分子荧光染料对人体内源性黑色素纳米颗粒(MNPs)进行标记,构建一种新型生物相容性好,且集NIR-Ⅱ荧光成像、光声成像和光热治疗于一体的多功能纳米探针MNPH2,首先对该纳米探针的基本表征和性能进行研究,随后探索其作为一种双模态造影剂及诊疗一体化制剂在干细胞示踪与肿瘤诊疗中的应用。方法:1.NIR-Ⅱ小分子荧光染料H2标记仿生黑色素纳米颗粒,构建多功能纳米探针MNPH2,并对其基本表征和性能进行研究。1.1利用仿生MNPs与NIR-Ⅱ荧光小分子染料H2化学反应获得MNPH2多功能纳米探针。1.2对MNPH2的TEM、FT-IR、稳定性、DLS、Zeta电位以及UV-Vis-NIR光吸收波谱等基本表征进行研究。1.3研究MNPH2的体外NIR-Ⅱ荧光成像、PA成像和光热转化性能。1.4通过体外溶血实验和大剂量活体注射对MNPH2的生物安全性进行评估。2.MNPH2标记hUMSCs后活体内长期NIR-Ⅱ FI/PAI双模态示踪并实现治疗急性肝损伤过程的可视化和疗效评估。2.1 CLSM、NIR-Ⅱ荧光显微镜和FCM分析hUMSCs对MNPH2的摄取能力(即MNPH2体外标记hUMSCs的能力)。2.2 CCK-8实验分析MNPH2对hUMSCs增殖活性的影响,成骨、成脂诱导分化实验分析MNPH2对hUMSCs分化能力的影响。2.3对MNPH2标记的hUMSCs行体外NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像。2.4 MNPH2标记的hUMSCs经皮下注射移植入活体后长期行NIR-Ⅱ FI/PAI双模态示踪观察。2.5 MNPH2标记的hUMSCs经静脉注射移植入急性肝损伤小鼠后行可视化治疗和疗效评估。3.MNPH2对喉癌行NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像引导光热治疗的诊疗一体化研究。3.1 CCK-8实验评估MNPH2对Hep-2细胞的增殖活性影响,NIR-Ⅱ荧光显微镜和CLSM观察Hep-2细胞对MNPH2的摄取能力,Calcein-AM/PI活死细胞双染分析MNPH2对Hep-2细胞的光热毒性。3.2构建喉癌活体肿瘤模型,并对其进行活体NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像。3.3评估荷喉癌裸鼠在NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像引导下肿瘤光热治疗的效果。结果:1.通过简单的一步法合成了具有良好生物相容性、NIR-Ⅱ FI和PAI以及光热转化性能的多功能纳米探针MNPH2。1.1 H2末端具有-COOH,在EDC/NHS的催化作用下与MNP-PEG末端的-NH2发生脱水缩合,形成酰胺键后连接起来,且每个MNP-PEG分子能够结合22个H2分子。1.2 MNPH2具有良好的水溶性和生理稳定性;TEM图像中MNPH2颗粒呈类圆形,大小一致,分布比较均匀;MNPH2的FT-IR光谱图中有酰胺键的吸收峰存在,证明了MNP-PEG与H2成功连接;MNPH2的水合粒径为33 nm,zeta电位为-13.3m V;UV-Vis-NIR吸收光谱显示MNPH2在近红外区有特征吸收峰,波峰位置处于768 nm。1.3 MNPH2具有良好的NIR-Ⅱ荧光和PA成像性能,且荧光信号和光声信号均随溶液浓度的增高逐渐增强,两者具有良好的相关性;MNPH2还显示出优良的光热转化效率和光热稳定性。1.4溶血实验结果表明MNPH2不会引发红细胞破碎导致溶血;大剂量MNPH2注射入小鼠活体后无明显的肝肾功能异常发生,且主要脏器的HE染色无异常病理学改变。2.MNPH2作为NIR-Ⅱ FI和PAI探针,实现活体内对hUMSCs的长期双模态示踪,以及hUMSCs治疗小鼠急性肝损伤过程的可视化和疗效评估。2.1 CLSM和NIR-Ⅱ荧光显微镜结果证明hUMSCs能通过简单的共培养方式将MNPH2颗粒摄取入细胞质内;FCM定量分析结果表明共培养4小时后,hUMSCs对MNPH2的摄取能力高达98.57%。2.2 CCK-8结果表明当MNPH2的浓度低于800μg/m L时,不会影响hUMSCs的增殖活性;成骨、成脂诱导分化实验证明hUMSCs经MNPH2标记后并不会影响其分化潜能。2.3 MNPH2成功标记hUMSCs后能够实现细胞在体外的NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像,且细胞数量越多,信号越强。2.4 MNPH2体外标记的hUMSCs经皮下注射移植入小鼠活体后,移植部位会发出NIR-Ⅱ荧光和PA信号,且信号随时间延长而逐渐减弱,至示踪第21天基本消失。2.5 MNPH2标记的hUMSCs经静脉注射移植入急性肝损伤小鼠后,NIR-Ⅱ FI和PAI都表明绝大多数细胞定植于损伤的肝脏组织内,并于注射后6小时细胞数量最多;NIR-Ⅱ FI也表明部分hUMSCs可经由肝-肠轴代谢排出体外。治疗过程中小鼠体重、血清学和组织病理学指标均表明hUMSCs能对小鼠急性肝损伤疾病发挥良好的治疗效果,且非瞬时作用。3.MNPH2作为诊疗一体化制剂用于活体喉癌的NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像引导的光热治疗。3.1 CCK-8结果表明MNPH2不会对Hep-2细胞的增殖活性产生影响;但若加以激光照射,MNPH2会释放热能杀伤细胞,导致细胞活性大幅度下降,且MNPH2孵育浓度越高,细胞活性越低;NIR-Ⅱ荧光显微镜和CLSM荧光图片表明Hep-2与MNPH2共孵育后会发生摄取;Calcein-AM/PI活死细胞双染从细胞层面再次证实MNPH2通过光热转化效应产生的热量足以杀死Hep-2细胞。3.2喉癌活体NIR-Ⅱ FI和PAI表明MNPH2经尾静脉注射后肿瘤被逐渐“点亮”,肿瘤组织的NIR-Ⅱ荧光和PA信号随时间延长而逐渐增强,于注射后8小时达到峰值,随后逐渐减弱。荷瘤小鼠主要脏器和肿瘤组织的NIR-Ⅱ FI图像表明MNPH2主要通过肝肠代谢排出体外。3.3在NIR-Ⅱ FI和PAI引导下对喉癌进行近红外激光照射,肿瘤局部温度升高至59.2℃,达到了杀伤肿瘤细胞的效果;对荷瘤小鼠的体重、肿瘤体积及肿瘤组织的HE染色分析表明MNPH2具有良好的光热治疗肿瘤的效果,且无副作用产生。结论:本研究以仿生型黑色素纳米颗粒为基础,通过一步法合成了集NIR-Ⅱ FI和PAI以及PTT治疗为一体的多功能纳米探针MNPH2。该探针具有以下优势:1)良好的水溶性和生理稳定性;2)优异的近红外光吸收特性;3)良好的生物安全性;4)NIR-Ⅱ荧光和PA成像性能;5)较高的光热转化效率和光热稳定性。该纳米探针实现了长期活体示踪皮下移植hUMSCs和治疗小鼠急性肝损伤的可视化,同时还能够实时无创动态监测活体肿瘤,在NIR-Ⅱ FI和PA双模态成像的引导下进行喉癌光热治疗。总之,MNPH2既可用于干细胞示踪和再生医学,又能用于肿瘤的诊疗一体化。本项研究进一步推动了以黑色素为核心的多功能纳米探针在生物医学领域应用的节奏,为其潜在的临床转化做准备。
李健[5](2021)在《应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究》文中认为旋毛虫(Trichinella spiralis,T.spiralis)是一种人兽共患食源性寄生虫,生食或半生食含有旋毛虫的猪肉及其产品是人类感染旋毛虫的主要方式,因感染旋毛虫而引起的疾病被称为旋毛虫病(Trichinellosis),该病呈世界性分布且严重威胁人类健康和公共安全,因此,猪旋毛虫检测被列为屠宰必检项目。目前使用的旋毛虫检测方法存在技术短板,无法满足对日常养殖和现代化屠宰加工过程中,猪体内旋毛虫的监测。因此,针对现代化大型养殖和屠宰场研发一种快速、灵敏的旋毛虫现场检测方法,对于旋毛虫病防控具有重要意义。本研究基于表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)和上转换发光免疫层析法(Upconversion phosphor immunochromatography assay,UCP-ICA)建立旋毛虫快速检测体系,为研发适用于现代化大型养殖和屠宰场的旋毛虫检测方法奠定基础,具体研究内容和结果如下:1.基于SERS建立旋毛虫检测方法。利用盐酸羟胺还原硝酸银,制备银纳米溶胶,测试其拉曼光谱增强性能及其对实验样品的影响。20只Wistar大鼠口服感染旋毛虫肌幼虫(Muscle larvae,ML)(3500条/只),并设平行空白对照组(20只Wistar大鼠)。收集血清,采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪采集未感染的血清及感染后28天血清的SERS,对SERS进行去荧光背景及面积归一化处理。比较SERS变化以及通过多元统计分析,如主成分分析(Principal component analysis,PCA)和线性判别分析(Linear discriminant analysis,LDA),分析SERS并建模。结果表明,所制备的银纳米溶胶颗粒直径约为25 nm,大小均匀,纯度高,且具有良好的拉曼光谱增强效果。感染组和对照组在未感染旋毛虫时的血清拉曼光谱无显着差异;第28天,两组的血清拉曼光谱出现显着差异。通过PCA结合LDA构建诊断算法,发现该方法灵敏度为87.5%,特异度为94.7%,正确度为91.4%。基于以上结果,将银纳米胶体的SERS与PCA和LDA相结合,有望实现大规模、现场、快速、无标记、高准确检测,在旋毛虫病防控方面具有巨大的应用潜力。2.基于UCP-ICA建立旋毛虫免疫层析检测法。将旋毛虫排泄分泌抗原(Excretorysecretory antigens,ES)、山羊抗兔Ig G与上转换发光纳米颗粒(Upconversion nanoparticles,UCNPs)共价偶联,以山羊抗猪Ig G(800 ng/条)与兔抗山羊Ig G(200 ng/条)喷于硝酸纤维素薄膜(Nitrate cellulose sheet,NC sheet)上,分别作为检查带(T线)与质控带(C线),并且命名该方法为旋毛虫上转换发光免疫层析法(T.spiralis upconversion phosphor immunochromatography assay,Ts-UCP-ICA)。Ts-UCP-ICA优化后的最佳血清稀释倍数为1:150、最佳样品处理液为100 m M HEPES p H 7.5,270 m M Na Cl,0.5%v/v Tween-20,1%v/v BSA。通过检测169份阴性猪血清,确定Ts-UCP-ICA的低特异度cut-off值为0.1906(T/C ratio),高特异度cut-off值为0.3233。检测猪囊尾蚴、亚洲带绦虫幼虫以及弓形虫感染后的猪血清样本,结果显示,Ts-UCP-ICA特异性良好,均未发生交叉反应。检测感染100、1000、10000 ML猪血清,发现三个剂量分别在第35、30、25天可检出阳性。Ts-UCP-ICA单盲测试(Single-blinded assay)55份猪血清,使用低特异度cut-off值时,检测特异度和灵敏度均100%,使用高特异度cut-off值时,检测特异度为100%和灵敏度为80%。该方法与人工消化法的检测总符合率为87.27%,一致性系数(Kappa值)为0.7454,稳定性为4℃保存6个月有效。本论文建立的两种旋毛虫检测方法,构成“旋毛虫快速检测体系”。基于SERS建立的旋毛虫检测法具有检测速度快,高通量的特点,适合大规模样本筛查;而基于UCP-ICA建立的旋毛虫检测方法可用于可疑血清进一步确定。该检测体系可提高检测效率和检测效果,进一步提升旋毛虫流行病学调查、畜牧养殖及屠宰即时检测水平,为旋毛虫病防控提供技术保障。
马桂兰[6](2021)在《低成瘤性MDCK单克隆细胞系的建立、成瘤性分析及应用研究》文中提出MDCK细胞是从犬肾组织中分离培养得到的上皮型贴壁细胞,但目前国内引进的该细胞系具有明显的成瘤性特点,并不是最佳的疫苗生产细胞基质。本研究首先对新引进的MDCK细胞系建立了三级细胞库,并对主库细胞的生长特点、成瘤性等特性进行了全面分析。在此基础上,利用单细胞克隆技术筛选并建立了具有低成瘤性的MDCK单克隆细胞系,该细胞系能够高效、稳定的用于流感病毒的增殖。我们还通过高通量测序技术分析了具有不同成瘤性的MDCK细胞的基因转录组学特点,初步揭示了与低成瘤性密切相关的潜在分子及相关机制。最后,利用微载体将贴壁型低成瘤的MDCK-C09在250m L悬浮瓶和75L生物反应器中进行适应性培养,旨在将该细胞株应用于疫苗生产实践。本研究进行了以下实验:(1)为建立低成瘤性、高增殖率的单克隆MDCK细胞系,本研究对新引进的MDCK细胞系建立了原始细胞库、主细胞库和工作细胞库,并对主细胞库细胞的形态学、生长特点、外源污染物、成瘤性等进行了初步检定。检测结果表明,该MDCK细胞系经贴壁后生长形态规则,增殖速度快,生长旺盛;对于扩大培养-冻存-复苏后的细胞,其平均细胞活力为98.8%,为典型的“S”型生长曲线。微生物污染检测结果发现,MDCK细胞在培养过程中未被细菌、真菌、病毒及支原体等微生物感染。此外,鸡胚接种法以及乳鼠、成鼠接种法也均证明MDCK细胞系未被病毒性外源因子污染。但细胞成瘤性检查发现,引进的MDCK细胞对裸鼠成瘤率为100%。因此,该细胞并不是最佳的疫苗生产细胞。该细胞系为驯化筛选出低成瘤性MDCK细胞提供了材料基础。(2)流感是一种急性呼吸道感染性疾病,由流感病毒引起。而接种流感疫苗被广泛认为是预防该疾病发生于传播的最好方式。MDCK细胞是流感病毒培养、分离流感病毒的主要细胞基质,但其高成瘤性是生产流感疫苗的主要不确定因素。本研究通过对单细胞克隆培养,筛选建立了低成瘤性的MDCK单克隆细胞系。首先挑选出10个单克隆细胞建立原始细胞库,通过进一步扩大培养,发现MDCK-C23,C25,C26,C35细胞形态成细胞岛样,单层形成时间为72~96h,而MDCK-C01,C04,C09,C19,C20,C21细胞形态成纤维样,单层形成时间为48~72h。通过染色体分析,发现MDCK-C09,C23,C35细胞群中含2n=78±2染色体占到了80%以上。通过裸鼠注射、病理组织切片及免疫组化结果分析,发现MDCK-C09、MDCK-C23、MDCK-35成瘤率分别为0/10、1/10和3/10;进一步通过低成瘤性单细胞克隆株增殖流感病毒的敏感性测试,发现H1N1和BX-35流感病毒可以在MDCK-C09和MDCK-C35中快速稳定地增殖。因此,MDCK-C09和MDCK-C35具有进行高效流感疫苗生产的潜力。(3)针对细胞成瘤性的问题,进行生物信息学分析构建相关分子调控网络,探讨成瘤机制。通过进一步对MDCK-C09、MDCK-C35和MDCK-W73细胞进行RNA-seq分析,构建与肿瘤分子相关的差异中心表达基因的相互作用网络。结果分析表明,APP、Huwe1、CUL3和EGFR可能在MDCK-C(MDCK-C09和MDCK-C35)和MDCK-W(MDCK-W73)细胞的成瘤性差异中发挥重要作用。此外,对细胞增殖调控相关分子相互作用的分析显示,JUN和MYC基因表达下降,并介导了细胞的增殖增加。本研究通过分析其低成瘤性和高增殖率的潜在分子机制,为高效流感疫苗生产奠定了基础。(4)探究低成瘤性的单克隆细胞株MDCK-C09在微载体中的适应性,在250 m L PC悬浮培养瓶中细胞传球培养以及在75L生物反应器中的初步应用。采用微载体培养MDCK-C09细胞,考察因素对细胞生长和增殖的影响。结果表明,不同的处理方式、细胞接种量和不同来源的血清都会影响细胞在微载体上的生长和增殖。用250m LPC悬浮培养瓶培养MDCK-C09细胞时,使用GF240微载体传代培养,可以采用不离心的传代方式,以30个/球的细胞接种量可以有效地促使细胞生长和增殖,另外,初步降血清的结果表明,MDCK-C09细胞能够逐渐适应低血清环境。在75L日泰生物反应器中细胞代谢分析表明,反应器运行过程中能够提供细胞所需的充足的葡萄糖、谷氨酰胺,而乳酸和氨等代谢废物积累未对细胞的生长造成不良影响。本文由MDCK贴壁细胞逐步筛选建立了具有低成瘤性、高病毒增殖率的MDCK单克隆细胞系,并进一步研究了该细胞系潜在的成瘤性分子机制和生产应用特性,以期为更高效地生产流感疫苗提供工艺开发中的细胞基础。
李民杰[7](2021)在《大肠杆菌运动调控在生物材料植入感染中的作用研究》文中认为[背景和目的]生物材料(biomaterial),也被称为生物医用材料(biomedical material),是指一类能对机体的细胞、组织和器官进行诊断、治疗、替代、修复、诱导再生或者增进其功能的特殊材料。随着科技的不断发展,生物材料植入已经成为现代医学诊疗过程中不可或缺的一部分;然而,生物材料植入又是一把双刃剑,在给患者带来显着效益的同时,也增加了感染的风险。生物材料植入感染(biomaterial centered infection,BCI)已经成为慢性难治性医院内感染,有报道占院内感染的50%。生物膜被定义为细菌黏附于生命或非生命物表面,并被自身分泌的胞外多聚物质(Extra polymeric substance,EPS)所包裹而形成的高度复杂的多细胞复合体。EPS是所有生物膜的基本结构特征,包括蛋白质、多糖及核酸等。生物材料植入增加了细菌入侵机体的途径,同时降低了诱发感染的最低细菌数量;医用生物材料作为异物不仅影响机体的免疫机制,还能为游离细菌提供粘附位点,促进细菌生物膜(bacterialbiofilm,BF)形成。生物材料表面一旦形成生物膜,膜内细菌能抵御抗生素及机体免疫系统清除,导致感染反复发作、迁延不愈,是临床诊疗过程中最常见、最严重的并发症之一。大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性、杆状兼性厌氧细菌,位于温血动物胃肠道中,是共生菌,一般情况下不会导致机体感染;另外,大肠杆菌在土壤及水中也能存活,特殊情况下也会造成机体感染。比如:第一,当机体皮肤和粘膜破坏时,可随生物材料植入进入机体,并黏附在材料表面形成生物膜;第二,外科手术过程中控制性降压、失血性休克以及长期禁食、胃肠外营养患者,肠道细菌移位可造成菌血症,血液中的细菌为生物材料表面生物膜形成提供菌源。研究显示大肠杆菌占肠道细菌移位细菌的半数以上;研究也显示心脏瓣膜置换术等相关术后生物材料感染中,大肠杆菌的检出率大约为3-10%。环二鸟苷酸(cyclic diguanylate monophsphate,c-di-GMP)是细菌中普遍存在的第二信使。研究发现,环二鸟苷酸调节细菌多种功能,包括:鞭毛运动、黏附、细胞周期起始和调控、毒力因子合成以及生物膜形成等。环二鸟苷酸对许多细菌最重要的影响是决定细菌“生活方式”,尤其是控制细菌在浮游运动状态和固着、生物膜状态之间转换。一般来讲,细菌细胞中环二鸟苷酸浓度水平增高可抑制鞭毛运动性,并增加胞外多聚物质(extracellularpolymeric substances,EPS)合成,从而导致生物膜形成;低浓度水平环二鸟苷酸增加细菌运动性,并分散生物膜。由此推测,环二鸟苷酸调节鞭毛运动介导细菌生物膜形成。细菌体内环二鸟苷酸水平依靠双鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclases,DGCs)和磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs)共同维持平衡。环二鸟苷酸通过调节鞭毛制动蛋白YcgR从而抑制鞭毛运动,而调节YcgR相关的双鸟苷酸环化酶DGCs主要包括DgcE和DgcQ。研究发现,ΔpdeH的大肠杆菌菌株运动性大幅下降,但ΔdgcE、ΔdgcQ和ΔpdeH三基因同时缺失的菌株则可恢复与野生型菌株相近的运动能力。由此可见,dgcE和dgcQ与大肠杆菌鞭毛运动调节密切相关。鉴于环二鸟苷酸信号在细菌中高度保守,且环二鸟苷酸促进生物膜形成;因此,与其代谢相关的酶可能是干扰细菌生物膜形成极具吸引力的靶点,尤其是生成c-di-GMP的双鸟苷酸环化酶(DGCs)。阐明环二鸟苷酸dgcE、dgcQ信号在细菌生物膜中的作用,即调节核苷酸水平或干扰信号通路可能抑制生物膜形成或促进生物膜分散。基因敲除技术是研究基因功能的有效工具。通过同源重组技术想要获得突变株的筛选,将耗费大量的时间和精力;CRISPR/Cas9系统作为一种高效的基因组编辑技术,具有制备简单、靶向性强、成本低和脱靶率低等诸多优势,极大地促进了基因功能研究。本研究采用CRISPR/Cas9技术构建大肠杆菌ATCC25922菌株dgcE、dgcQ基因敲除菌株,在前期建立生物材料表面生物膜模型基础上,采用激光共聚焦、扫描电镜等技术,探讨大肠杆菌dgcE、dgcQ对生物材料表面细菌生物膜形成的影响;通过构建大鼠菌血症模型,探讨大鼠体内不同大肠杆菌的清除以及生物材料表面细菌生物膜形成的影响;揭示防治生物材料表面大肠杆菌生物膜形成的有效分子靶标,为防治生物材料大肠杆菌相关感染提供实验依据。[方法]本研究分为三个部分:1.应用Crispr/Cas9技术构建大肠杆菌dgcE、dgcQ基因敲除菌株:以大肠杆菌ATCC25922为研究对象,使用dgcE、dgcQ引物序列完成相应基因PCR扩增检测,进一步完成dgcE、dgcQ基因序列Sanger测序检测,并与NCBI序列对比;参考gRNA设计原则完成gRNA设计,参考CRISPR-Vector载体方法构建目标序列载体。完成大肠杆菌ATCC25922(E.coli)感受态制备,参考电转感受态制备方法制备大肠杆菌ATCC25922(E.coli)感受态,CRISPR-Vector转化至大肠杆菌ATCC25922(E.coli)电转感受态,涂布至筛选培养基,培养3-5天,kan&spe双抗性板完成基因编辑菌株筛选。菌株PCR鉴定,PCR序列sanger测序验证DgcQ基因和DgcE基因分别敲除结果,DgcQ基因和DgcE基因敲除菌株分别保存。2.测定大肠杆菌dgcE、dgcQ在细菌生物学表型变化及在生物材料表面细菌生物膜形成中的作用:①、采用测定菌液光密度法绘制大肠杆菌ATCC25922、ATCC25922ΔdgcE和ATCC25922ΔdgcQ生长曲线,测量细菌在半固体培养基上的运动环直径大小反应细菌运动能力。探讨dgcE、dgcQ在细菌生物学表型变化中的作用。②、以三株大肠杆菌(ATCC25922、ATCC25922ΔdgcE和ATCC25922ΔdgcQ)为实验菌株,建立PVC材料表面细菌生物膜体外模型。采用半定量方法检测大肠杆菌生物膜形成能力,应用激光共聚焦(CLSM)动态观察PVC材料表面大肠杆菌生物膜形成过程、细菌群落数量以及细菌生物膜厚度等;应用扫描电镜(SEM)观察PVC材料表面大肠杆菌细菌生物膜表面结构。探讨dgcE、dgcQ在生物材料表面细菌生物膜形成中的作用。3.大鼠体内大肠杆菌的清除以及生物材料表面细菌生物膜的形成:SPF级健康雄性SD大鼠随机分为四组:空白对照组,ATCC25922组,ATCC25922ΔdgcE组和ATCC25922ΔdgcQ组。水合氯醛联合利多卡因麻醉后,通过尾静脉注射菌液建立菌血症模型,并经大鼠腹部正中切口将PVC材料放入腹膜腔。在24小时后处死大鼠,严格无菌条件下取门静脉血进行白细胞计数、PCT检测以及血液中细菌数测定;琼脂平板上的菌落行革兰氏染色鉴定,同时行菌落PCR鉴定;将体内生物材料一片用于细菌培养,再行菌落PCR鉴定;SEM观察体内材料表面生物膜结构;HE染色观察肺组织损伤情况。[结果]1.成功构建大肠杆菌dgcE、dgcQ基因敲除菌株:菌落PCR及Sanger测序结果表明,dgcE、dgcQ两个基因内部序列已被删除,且无相应卡那霉素及大观霉素抗性基因,基因被成功敲除。2.dgcE、dgcQ在大肠杆菌生物学表型变化及生物材料表面细菌生物膜形成中的作用:①、ATCC25922、ATCC25922ΔdgcE、ATCC25922ΔdgcQ三株大肠杆菌在TSB培养基中生长无明显差异(P>0.05);②、相对于ATCC25922,ATCC25922ΔdgcE 及 ATCC25922ΔdgcQ 运动能力明显增加(P<0.05);并且ΔdgcQ比ΔdgcE基因敲除株运动能力更强(P<0.05)。③、在4-8h时基因敲除菌株生物膜形成能力大于标准菌株,且在8h时具有明显统计学意义(P<0.05)。大肠杆菌ATCC25922生物膜形成峰值时间为12h,但基因敲除菌株形成生物膜峰值时间为8h,较标准株提前;④、三种菌株在4-8h生长动力学呈上升趋势,超过8h后其生长动力学呈下降趋势;且各个时间点大肠杆菌ATCC25922标准菌株生长动力学明显大于基因突变菌株,在8h、12h、24h时与ΔdgcQ相比差异具有统计学意义(P<0.5);⑤、大肠杆菌ATCC25922单位面积细菌菌落数大于ΔdgcE及ΔdgcQ,差异具有统计学意义(P<0.05);但基因突变菌株之间无明显差异(P>0.05);⑥、大肠杆菌ATCC25922菌株生物膜厚度较基因敲除株厚(P<0.05);且在8h时,ATCC25922-ΔdgcE 较 ATCC25922-ΔdgcQ 厚,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.大鼠体内大肠杆菌的清除以及生物材料表面细菌生物膜的形成:①、菌血症模型组白细胞数较空白对照组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);但三组菌血症模型之间无明显差异(P>0.05);②、对于血浆中降钙素原(PCT)水平,菌血症模型组与对照组相比明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);三个菌血症模型组之间两两比较具有统计学意义(P<0.05);③、在感染24h时,ATCC25922标准菌株组的活菌数量最高,达到3X103CFU/ml。菌血症动物模型组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),且ATCC25922-ΔdgcE组、ATCC25922-ΔdgcQ组与ATCC25922标准菌株组相比差异有统计学意义(P<0.05),二者间比较差异无统计学意义;④、ATCC25922标准株、ATCC25922-ΔdgcE及ATCC25922-ΔdgcQ组生物材料表面细菌数均较对照组显着升高,差异具有统计学意义(P<0.05);同时,ATCC25922标准菌株组材料表面细菌数较ATCC25922-ΔdgcE 及 ATCC25922-ΔdgcQ 组多,与 ATCC25922-ΔdgcQ 组相比差异具有统计学意义(P<0.05);⑤、ATCC25922标准菌株组较ATCC25922-ΔdgcE组、ATCC25922-ΔdgcQ组对大鼠肺组织的损伤重。[结论]1.运用CRISPR/Cas9技术可成功构建大肠杆菌dgcE、dgcQ基因敲除菌株,为后续相应基因功能研究奠定基础;dgcE、dgcQ基因敲除能增强大肠杆菌运动能力,但不影响细菌生长;2.dgcE和dgcQ在生物膜形成过程中具有双重功能,即:低水平c-di-GMP对于早期附着是重要的,而在成熟生物膜中需要高水平c-di-GMP以促进基质产生,这与生物膜形成过程中的黏附、聚集相一致;dgcE和dgcQ基因敲除影响胞外多聚物质产生,导致生物膜结构不稳定。因此,可能是生物材料植入感染潜在治疗靶标。3.大肠杆菌dgcE和dgcQ基因缺失,引起c-di-GMP水平下降,导致大鼠免疫系统对细菌清除效率增加;并且在大鼠菌血症期间,大鼠体内生物材料表面生物膜形成降低,以及对大鼠肺组织损伤减轻。
朱立猛[8](2021)在《壳寡糖对阿尔茨海默病的作用效果评价及其机制初探》文中认为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种起病隐匿的进行性发展的中枢神经系统退行性疾病,临床表现主要为认知和记忆障碍。从被发现至今,人们对AD的相关研究已经取得了巨大的进展,众多研究数据表明,AD的发病可能由多种因素共同参与,导致其病程漫长,病理机制十分复杂,且尚未有根治的方法。现有药物主要是缓解症状,不能阻止或者逆转疾病的发展。由于病理机制不明确,导致传统的治疗策略很难有效控制或治愈包括AD在内的多种复杂疾病。近年来,AD的治疗策略也逐渐发生变化,从单一治疗策略到多环节整体观的治疗策略。相对于单一的治疗策略,多环节整体观的治疗可针对疾病的不同生理环节发挥作用并且具有不良反应少、疗效显着等优点。天然产物及其衍生物由于生物利用度高、毒副作用小且大多具有多功能的特性而备受关注。因此,将具有良好生物活性的天然产物用于AD相关的治疗或许可以成为一种有效可行的策略。壳寡糖(Chitosan oligosaccharide,COS)是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖,具有多种生物活性,在生物医药和功能食品领域表现出了良好的应用前景,且COS在过去的许多研究中都被证明具有良好的神经保护作用。本论文通过细胞和动物实验,评价了 COS对于AD的改善作用,并探究了其相关作用机制,为合理地将COS用于AD的治疗提供一定理论依据。论文具体开展的工作如下:1)COS在过去的许多研究中都被证明具有良好的神经保护作用,然而相关的研究存在许多不足。绝大多数的研究仅利用体外细胞模型进行相关实验验证,但是关于COS是否可以穿透血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)进入大脑发挥其神经保护作用依然是个未知数。针对该问题,本研究构建了两种由单层微血管内皮细胞组成的体外BBB模型:静态Transwell模型和动态微流控芯片模型,并利用以上两种模型探究了 COS能否透过单层微血管内皮细胞构成的BBB。初步证明COS具有良好的BBB透过性,且葡萄糖转运蛋白1(Glucose transporterl,GLUT-1)是其通过BBB的转运载体之一。此外,利用荧光标记与活体成像联用的技术,在活体动物上验证了 COS可以透过BBB进入大脑。2)β淀粉样蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)自聚集生成富含β-sheet结构的有序聚集体,是导致AD的罪魁祸首。因此,通过影响Aβ的聚集来降低Aβ诱导产生的神经毒性可能是治疗AD的一种有效途径。本研究发现COS可以通过影响Aβ42的聚集来降低其诱导产生的细胞凋亡、氧化应激和炎症因子的释放。其作用机制为:COS能够通过静电作用和疏水相互作用结合在Aβ42寡聚体上,结合后会进一步破坏β-sheet结构,并使其转变为β-turn和Coil结构。该变化会扰乱Aβ42自身所具有的分子内结合作用,破坏Aβ42寡聚体的固有结构,使其稳定性降低,进而促进已经聚集的Aβ42纤维体解聚。除此之外,COS的结合占据了 Aβ42聚集体表面的某些特定位点,导致Aβ42聚集过程中无法向正常方向延长,从而有效地抑制Aβ42的聚集。以上作用能够显着降低Aβ42诱导产生的神经毒性。此外,COS的该作用与其剂量、聚合度和脱乙酰度成正比,-NH2基团在二者相互作用的过程中发挥了重要的作用。3)肠道菌群在AD的发生和发展有中发挥着重要的作用。通过个性化益生元干预来调节肠道微生物群可能成为治疗AD的新方法。本研究通过动物实验,探究了 COS能否通过调节肠道菌群和其代谢产物改善AD相关病理症状。结果表明,COS可以显着改善AD小鼠的认知和记忆功能损伤,降低Aβ引起的神经元凋亡和突触功能障碍。此外,COS治疗还可以重塑紊乱的肠道菌群,改善失衡的菌群代谢,修复受损的肠屏障,减轻外周慢性炎症。通过伪无菌小鼠和粪便菌群移植实验,我们发现COS或可以通过多种途径,整体协同改善AD小鼠的认知功能障碍。综上所述,本研究为将COS用于AD的治疗提供了一定的理论基础。
张微云[9](2021)在《空心金纳米棒的设计合成及其在肿瘤诊疗中的应用研究》文中认为具有表面等离子体性质的贵金属纳米结构在生物医学领域展现了良好的应用前景,尤其是化学性质稳定的金纳米结构。虽然已有多种多样的金纳米结构被制备并用于生物医学研究,但是由于金纳米结构的表面等离子体吸收峰与其尺寸、形貌有密切关系,目前只有极少数金纳米结构的表面等离子体吸收峰可以在可见-近红外区进行调节,而具有近红外二区窗口相应的金纳米材料则更为凤毛麟角。因此,设计合成具有近红外二区窗口表面等离子体吸收峰的金纳米材料具有重要的研究价值。本文使用碲纳米粒子作为模板,通过电置换取代反应制备出了空心金纳米棒,并对其在生物医学的应用进行了一系列研究探索。主要内容如下所述:(1)长径比可调的空心金纳米棒的设计合成及其在近红外二区诊疗的应用研究。设计新型的具有近红外二区响应的金纳米材料在生物医学领域具有极佳的应用前景。首先合成长径比可控的碲纳米棒,然后利用碲纳米棒作为化学模板与金前体进行反应,在半胱氨酸的作用下,成功制得空心金纳米棒,其长径比在1.96.0范围可调。由于空心结构的原因,它们只需要长径比为3即可将等表面离子体吸收峰调节到近红外二区。吸收峰在1064 nm左右的空心金纳米棒在对应激光波长下的光热转换效率为33%。细胞实验显示这种空心金纳米棒具有良好的生物相容性。空心金纳米棒不仅成功应用于小鼠的光热成像、CT成像、光声成像,而且在空心金纳米棒表面修饰抗癌药物时,它们展现了良好的化疗-光热联合抗肿瘤的效果。(2)空心金纳米棒嵌合肽纳米平台在近红外二区诊疗中的应用研究。用嵌合肽对空心金纳米棒进行修饰可以制备多功能的纳米诊疗平台。首先合成了含光敏剂与可被caspase-3定向切断多肽序列组成的嵌合肽,通过这种含光敏剂的嵌合肽对空心金纳米棒进行表面修饰,得到了能进行光热治疗、光动力治疗以及实时凋亡诊断的纳米诊疗平台。其中光敏剂分子在释放前是被猝灭的,在对肿瘤组织进行光热治疗后,光敏剂分子在细胞凋亡产生的caspase-3酶作用下从空心金纳米棒表面释放并重新激活,可以对治疗过程中的细胞凋亡进行实时监控,同时在细胞凋亡开启之后释放光敏剂,之后可以根据治疗效果使用光动力治疗进行进一步的治疗。系统性的生物安全研究证明其具有良好的生物相容性并且能避免光敏剂对皮肤的光毒性,在体外与活体的实验中通过光热与光动力联合治疗实现了良好的治疗效果,活体荧光成像实现了对凋亡的实时监测。(3)小型化空心金纳米棒的制备及其在近红外二区诊断的应用研究。通过改进碲纳米棒的制备方法,获得了长度约为46 nm的碲硒纳米棒模板。再利用银辅助的合成方法调控电置换取代反应,成功制得了小型化的空心金纳米棒。它们在近红外二区具有较高的吸收,而且在1064 nm处的光热转换效率为34%。研究显示这种材料具有良好的生物相容性。在小鼠活体研究中,小型化空心金纳米棒相比大的空心金纳米棒在肿瘤处具有更好的蓄积效果,而且在修饰靶向分子和荧光分子之后,在荧光成像中显示的区别更大。在1064 nm光照下,小型化空心金纳米棒相比大的空心金棒,显示了更优良的光声成像造影效果。
刘涛[10](2021)在《海藻基水凝胶的制备与性能研究》文中研究说明多功能智能水凝胶不仅保持着水凝胶的传统性能(如高吸水性,高强度等),且通过对水凝胶进行修饰可以获得对外界环境变化做出反应的能力,如温敏性、p H敏感性、耐冻性、压阻性能等。本文首先以海藻酸钠(SA)为原材料,依次通过Ca2+和Zn2+离子交联,制备了双金属离子交联海藻基水凝胶,系统研究了水凝胶的抗冻性和抗压缩抗拉伸性能。针对离子交联海藻基水凝胶机械性能较差的问题,利用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)对海藻酸钠进行改性,赋予海藻酸共聚合性能,再与丙烯酰胺(AM)共聚形成具有高机械强度和高溶胀性能的共价交联水凝胶(GMA-SA-PAM)。并进一步将GMA-SA-PAM水凝胶与NaCl复合,获得了具有导电性能的水凝胶(GSP-Na),系统研究了水凝胶的溶胀性能、机械强度以及电化学性能。1.在海藻酸钠与Ca2+初步交联中,交联时间对水凝胶压缩强度有较大影响,最佳交联时间为24h。进一步引入Zn2+为交联剂,成功制备了具有优异抗冻性的钙锌离子双交联海藻基水凝胶,得到最佳合成条件。钙锌离子双交联海藻基水凝胶(含水量67.32%)分别在25℃、-18℃下,其压缩强度可达118.88 KPa、97.3KPa,拉伸率达到142%和129%,说明即使在-18℃低温条件下,水凝胶仍然具有良好的机械性能。2.基于SA与PAM成功制备了不同BIS用量的半互穿网络水凝胶(SA-PAM),随着BIS用量的增加,水凝胶溶胀性能逐渐减小,当BIS用量分别为1 Wt%、2Wt%时,合成的SA-PAM水凝胶的交联密度适中,溶胀性能良好。SA-PAM水凝胶的机械性能研究表明,当BIS用量为1 Wt%时,水凝胶的压缩强度为4.6 KPa,拉伸强度为0.59 MPa,扯断伸长率为368.3%,机械性能表现良好。3.通过Ca2+交联SA-PAM水凝胶,成功制备了全互穿网络结构的Ca-SA-PAM水凝胶,随着交联时间的延长,水凝胶的机械性能逐渐增大,交联48 h时,水凝胶的交联密度最大,水凝胶的压缩强度为26.37 KPa,拉伸强度为0.77 MPa,扯断伸长率为209.12%。实验表明,Ca2+与SA-PAM水凝胶的充分交联,可以使得水凝胶的交联密度增大,网络更加紧实。4.为了增加海藻酸钠的共聚合性能,将GMA引入在海藻酸钠长链上,得到改性海藻酸钠(GMA-SA),其接枝率为20.45%。5.将GMA-SA与AM共聚得到具有全互穿网络结构的水凝胶(GMA-SA-PAM),该水凝胶有着更加优异的溶胀性能和机械性能,水凝胶的压缩强度为21.63KPa、拉伸强度为0.86 MPa以及扯断伸长率为407%。6.通过负载NaCl,赋予了GMA-SA-PAM水凝胶导电性能,经过电化学测试,GSP-Na水凝胶拥有较大的电导率,达到了5.26s*m-1,GSP-Na水凝胶的机械性能以及稳定性都有着良好的表现,可用于基于电化学的应变传感器。
二、实验动物在生物技术药物生产中的应用(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、实验动物在生物技术药物生产中的应用(论文提纲范文)
(1)鸡胚模型在生物活性评价中的应用(论文提纲范文)
1 鸡胚的组织结构与特点 |
2 鸡胚模型在疾病机理及生物活性评价中的应用 |
2.1 鸡胚模型在神经系统相关疾病中的应用 |
2.2 鸡胚模型在血管系统相关疾病中的应用 |
2.3 鸡胚模型在心脏系统相关疾病中的应用 |
2.4 鸡胚模型在眼部系统相关疾病中的应用 |
2.5 鸡胚模型在肝脏系统相关疾病中的应用 |
2.6 鸡胚模型在骨骼系统相关疾病中的应用 |
2.7 鸡胚模型在肿瘤学研究中的应用 |
2.8 鸡胚模型在病毒和微生物等相关疾病中的应用 |
3 鸡胚模型在安全性评价中的应用 |
4 鸡胚细胞系在生物学研究中的应用 |
5 结语 |
(2)荧光聚合物点的细胞内吞定量及活体内细胞追踪研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第1章 绪论 |
1.1 引言 |
1.2 荧光探针 |
1.2.1 有机小分子染料 |
1.2.2 荧光蛋白 |
1.2.3 荧光纳米粒子 |
1.3 聚合物点 |
1.3.1 共轭聚合物 |
1.3.2 共轭聚合物的发光机理 |
1.3.3 聚合物点的制备方法 |
1.3.4 聚合物点的特性表征 |
1.3.5 聚合物点的表面功能化 |
1.3.6 荧光聚合物点的生物应用 |
1.4 论文选题意义及主要内容 |
第2章 细胞内吞聚合物点的荧光定量及其生物应用 |
2.1 引言 |
2.2 实验部分 |
2.2.1 实验试剂及仪器 |
2.2.2 聚合物点的制备及纯化 |
2.2.3 聚合物点的荧光稳定性与生物相容性测试 |
2.2.4 聚合物点的细胞穿膜肽修饰及其细胞标记 |
2.2.5 细胞内吞聚合物点的荧光光谱定量 |
2.2.6 细胞内吞聚合物点的电感耦合等离子体质谱定量 |
2.2.7 细胞内吞聚合物点的共聚焦显微镜定量和流式细胞术定量 |
2.2.8 聚合物点光敏剂对肿瘤细胞半抑制浓度的测定 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 聚合物点PFBT与 PFBT@Pt的制备与表征 |
2.3.2 细胞内吞聚合物点的荧光光谱定量和电感耦合等离子体质谱定量 |
2.3.3 细胞内吞聚合物点的共聚焦显微镜定量与流式细胞术定量 |
2.3.4 聚合物点PFBT@Pt对于肿瘤细胞MCF-7 的半抑制浓度测定 |
2.4 本章小结 |
第3章 掺杂型近红外荧光聚合物点应用于活体内细胞追踪三维成像 |
3.1 引言 |
3.2 实验部分 |
3.2.1 实验试剂及仪器 |
3.2.2 实验动物 |
3.2.3 聚合物点的制备及纯化 |
3.2.4 聚合物点生物相容性测试 |
3.2.5 聚合物点的细胞穿膜肽修饰及其细胞标记 |
3.2.6 细胞体内追踪 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 聚合物点的制备与表征 |
3.3.2 细胞穿膜肽介导的聚合物点高效标记 |
3.3.3 细胞体内追踪 |
3.4 本章小结 |
第4章 混杂型近红外荧光聚合物点的制备及其活体内多种细胞的追踪应用 |
4.1 引言 |
4.2 实验部分 |
4.2.1 实验试剂及仪器 |
4.2.2 实验动物 |
4.2.3 聚合物点的制备及纯化 |
4.2.4 聚合物点生物相容性测试及对肿瘤细胞的标记 |
4.2.5 人类脐带间充质干细胞的提取 |
4.2.6 聚合物点生物相容性测试及对干细胞的标记 |
4.2.7 肿瘤细胞与干细胞体内动态追踪 |
4.2.8 组织学分析 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 深红光激发、近红外发射聚合物点的制备与表征 |
4.3.2 聚合物点的细胞标记与生物相容性测试 |
4.3.3 体内肿瘤细胞与干细胞的动态追踪 |
4.4 本章小结 |
第5章 结论与展望 |
5.1 结论 |
5.2 展望 |
参考文献 |
作者简介及科研成果 |
致谢 |
(3)3nm氧化铁纳米颗粒对斑马鱼胚胎发育的毒性作用机制的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略语对照表 |
第一章 绪论 |
1.1 纳米颗粒的概述 |
1.2 铁氧纳米颗粒的研究 |
1.2.1 铁氧纳米颗粒的特性 |
1.2.2 铁氧纳米颗粒在生物医药领域的应用 |
1.3 超小亚五铁氧纳米颗粒的研究现状 |
1.4 斑马鱼在毒理学研究中的应用 |
1.4.1 模式生物斑马鱼 |
1.4.2 以斑马鱼作为血管和血细胞发育毒性的研究工具 |
1.4.3 以斑马鱼作为神经发育毒性的研究工具 |
1.4.4 以斑马鱼作为肝脏及肾脏发育毒性的研究工具 |
1.4.5 以斑马鱼作为肝脏及肾脏发育毒性的研究工具 |
1.4.6 以斑马鱼作为骨骼发育毒性的研究工具 |
1.5 斑马鱼胚胎在纳米毒理学中的应用 |
1.6 转录组测序技术和加权共表达网络分析 |
1.7 本研究的目的和意义 |
第二章 不同尺寸氧化铁纳米颗粒的毒理学研究 |
2.1 引言 |
2.2 实验材料 |
2.2.1 实验动物 |
2.2.2 实验试剂 |
2.2.3 溶液配制 |
2.2.4 实验仪器 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 不同尺寸的FeNPs制备与表征 |
2.3.2 FeNPs对斑马鱼胚胎的处理 |
2.3.3 胚胎活力统计分析 |
2.3.4 氧化胁迫和细胞凋亡检测 |
2.4 实验结果 |
2.4.1 3 nm FeNPs的表征 |
2.4.2 FeNPs对斑马鱼胚胎活力的影响 |
2.4.3 FeNPs导致的斑马鱼胚胎的畸形率 |
2.4.4 FeNPs对斑马鱼胚胎的氧化胁迫作用 |
2.4.5 FeNPs处理斑马鱼胚胎后的凋亡检测 |
2.5 小结和讨论 |
第三章 不同尺寸FeNPs对斑马鱼器官发育的形态学影响 |
3.1 引言 |
3.2 实验材料 |
3.2.1 实验动物 |
3.2.2 实验仪器 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 血红蛋白染色 |
3.3.2 原位杂交 |
3.3.3 油红染色 |
3.3.4 数据分析 |
3.4 实验结果 |
3.4.1 FeNPs对斑马鱼的心脏发育的影响 |
3.4.2 FeNPs对斑马鱼的血管发育的影响 |
3.4.3 FeNPs对斑马鱼的肝脏发育的影响 |
3.4.4 FeNPs对斑马鱼肾脏发育的影响 |
3.4.5 FeNPs对斑马鱼软骨发育的影响 |
3.5 小结和讨论 |
第四章 FeNPs对斑马鱼神经肌肉和运动系统发育的影响 |
4.1 引言 |
4.2 实验材料 |
4.2.1 实验动物 |
4.2.2 实验仪器 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 图像数据分析 |
4.3.2 行为学分析 |
4.4 实验结果 |
4.4.1 FeNPs影响斑马鱼胚胎的神经发育 |
4.4.2 3 nm FeNPs影响斑马鱼胚胎骨骼肌发育 |
4.4.3 不同粒径FeNPs对斑马鱼自发运动的影响 |
4.4.4 斑马鱼胚胎的运动轨迹分析 |
4.5 小结和讨论 |
第五章 3 nm FeNPs对不同时期的斑马鱼胚胎的转录组水平的毒性分析 |
5.1 引言 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 样品准备 |
5.2.2 高通量测序流程 |
5.2.3 RNA-Seq数据过滤与分析 |
5.2.4 实时定量荧光PCR |
5.3 实验结果 |
5.3.1 总RNA质检结果 |
5.3.2 RNA-Seq数据过滤和Reads的表达分布 |
5.3.3 斑马鱼胚胎发育不同时期的差异基因表达及分析 |
5.3.4 实时定量PCR验证数据可靠性 |
5.4 小结和讨论 |
第六章 加权共表达网络分析挖掘3 nm FeNPs对斑马鱼胚胎发育的毒性的关键基因 |
6.1 引言 |
6.2 实验材料 |
6.3 实验方法 |
6.4 实验结果 |
6.4.1 差异表达基因共表达模块的构建 |
6.4.2 模块内基因GO功能和KEGG pathway富集分析 |
6.4.3 关键hub基因的筛选 |
6.4.4 特定模块的共表达网络分析 |
6.5 小结与讨论 |
6.5.1 hub基因plcd1a对神经肌肉的毒性分析 |
6.5.2 hub基因prkcdb涉及的涉及的过氧化损伤和炎性反应 |
第七章 结论与展望 |
7.1 本文的主要结论 |
7.2 本文的创新点 |
7.3 展望 |
参考文献 |
附录一 转录组测序Clean reads的数量 |
附录二 转录组测序Clean reads参考基因组比对 |
附录三 引物序列表 |
攻读博士学位期间取得的科研成果 |
致谢 |
(4)近红外二区荧光染料标记黑色素纳米探针的构建及其应用研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
常用缩写词中英文对照表 |
前言 |
第一部分 NIR-Ⅱ荧光染料标记黑色素纳米探针(MNPH2)的合成、表征及性能 |
1 材料与方法 |
1.1 主要试剂和仪器 |
1.2 MNPH2 的合成 |
1.3 MNPH2 的基本表征 |
1.4 MNPH2 的体外PAI性能 |
1.5 MNPH2 的体外NIR-Ⅱ FI性能 |
1.6 MNPH2 的体外光热转化性能 |
1.7 MNPH2 的生物安全性能 |
1.8 统计学分析 |
2 结果 |
2.1 MNPH2 的合成与基本表征分析 |
2.2 MNPH2 的光声性能 |
2.3 MNPH2的NIR-Ⅱ荧光性能 |
2.4 MNPH2 的光热转化性能 |
2.5 MNPH2 的生物安全性评估 |
3 讨论 |
4 结论 |
第二部分 NIR-Ⅱ FI/PAI活体示踪hUMSCs并可视化治疗急性肝损伤 |
1 材料与方法 |
1.1 主要试剂与仪器 |
1.2 hUMSCs的提取与培养 |
1.3 hUMSCs摄取MNPH2、细胞活性及分化能力评估 |
1.4 hUMSCs体外NIR-Ⅱ荧光/PA双模态成像 |
1.5 NIR-Ⅱ荧光/PA双模态成像活体示踪移植hUMSCs |
1.6 活体移植hUMSCs治疗急性肝损伤的可视化修复过程和疗效评估 |
1.7 统计学分析 |
2 结果 |
2.1 模式图 |
2.2 CLSM、NIR-Ⅱ荧光显微镜及FCM分析MNPH2 的标记能力 |
2.3 MNPH2对hUMSCs细胞活性的影响 |
2.4 MNPH2对hUMSCs分化能力的影响 |
2.5 MNPH2 标记hUMSCs的体外双模态成像 |
2.6 活体NIR-Ⅱ FI和 PAI双模态长期示踪hUMSCs |
2.7 可视化研究hUMSCs治疗急性肝损伤及疗效评估 |
3 讨论 |
3.1 NIR-Ⅱ FI/PAI双模态活体示踪hUMSCs |
3.2 hUMSCs治疗小鼠急性肝损伤可视化研究及疗效评估 |
4 结论 |
第三部分 NIR-Ⅱ FI/PAI引导PTT在喉癌诊疗一体化研究中的应用 |
1 材料与方法 |
1.1 主要试剂与仪器 |
1.2 Hep-2 细胞培养 |
1.3 Hep-2 细胞增殖活性实验 |
1.4 Hep-2 细胞摄取MNPH2 能力评估 |
1.5 Hep-2 细胞光热杀伤效果分析 |
1.6 喉癌肿瘤模型构建 |
1.7 喉癌活体NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像 |
1.8 喉癌活体光热治疗效果分析 |
1.9 数据分析 |
2 结果 |
2.1 模式图 |
2.2 细胞毒性、细胞摄取和细胞光热杀伤效果分析 |
2.3 活体肿瘤NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像 |
2.4 活体光热治疗效果评估 |
3 讨论 |
3.1 MNPH2 纳米探针靶向诊断活体肿瘤 |
3.2 NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像引导的活体肿瘤光热治疗 |
4 结论 |
参考文献 |
综述 天然黑色素及其类似物作为一种多功能纳米平台 在生物医学领域中的应用 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介 |
(5)应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩写词 |
前言 |
第一篇 文献综述 |
第1 章 旋毛虫及旋毛虫病研究进展 |
1.1 旋毛虫及其生活史 |
1.2 旋毛虫病 |
1.3 旋毛虫检测方法的研究进展 |
第2 章 SERS在生物检测中的概况及应用 |
2.1 SERS概况 |
2.2 SERS在生物检测中的应用 |
第3章 UCP-ICA在生物检测中的概况及应用 |
3.1 UCP概况 |
3.2 UCP-ICA在生物检测中的应用 |
第二篇 研究内容 |
第1 章 基于SERS建立旋毛虫病快速筛查模型及评价 |
1.1 材料 |
1.1.1 实验动物和旋毛虫 |
1.1.2 主要试剂、耗材 |
1.1.3 主要实验仪器 |
1.1.4 主要溶液的配制 |
1.2 方法 |
1.2.1 旋毛虫ML收集 |
1.2.2 旋毛虫感染模型构建和血清样本制备 |
1.2.3 银纳米颗粒制备和表征 |
1.2.4 血清SERS光谱测量和收集 |
1.2.5 光谱数据处理和多元统计分析 |
1.3 结果 |
1.3.1 旋毛虫ML收集后鉴定 |
1.3.2 银纳米颗粒表征结果 |
1.3.3 SERS测试结果 |
1.3.4 血清SERS多元统计分析 |
1.3.5 血清SERS官能团发掘 |
1.4 讨论 |
1.4.1 SERS光谱 |
1.4.2 统计分析 |
1.5 小结 |
第2章 旋毛虫UCP-ICA制备及其优化 |
2.1 材料 |
2.1.1 旋毛虫虫种和实验动物 |
2.1.2 主要试剂、耗材 |
2.1.3 主要仪器 |
2.2 方法 |
2.2.1 旋毛虫ML收集及其ES抗原制备 |
2.2.2 旋毛虫ML-ES抗原鉴定 |
2.2.3 UCNPs-ES/山羊抗兔IgG制备与表征 |
2.2.4 旋毛虫UCP-ICA建立与优化 |
2.2.5 Ts-UCP-ICA的操作流程 |
2.2.6 阈值(cut-off)确立 |
2.2.7 Ts-UCP-ICA检测不同感染剂量阳性血清的效果评价 |
2.3 结果 |
2.3.1 旋毛虫ML-ES抗原的鉴定结果 |
2.3.2 UCNPs-ES/山羊抗兔IgG偶联表征 |
2.3.3 Ts-UCP-ICA建立与优化 |
2.3.4 Ts-UCP-ICA-cut-off值确定 |
2.3.5 Ts-UCP-ICA检测不同感染剂量阳性血清的结果 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第3章 Ts-UCP-ICA评价 |
3.1 材料 |
3.2 方法 |
3.2.1 Ts-UCP-ICA制备 |
3.2.2 特异性分析 |
3.2.3 单盲测试分析 |
3.2.4 一致性评价 |
3.2.5 稳定性分析 |
3.3 结果 |
3.3.1 特异性分析结果 |
3.3.2 单盲测试结果 |
3.3.3 一致性评价 |
3.3.4 稳定性分析 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
结论 |
参考文献 |
导师简介 |
作者简介及在学期间取得的科研成果 |
致谢 |
(6)低成瘤性MDCK单克隆细胞系的建立、成瘤性分析及应用研究(论文提纲范文)
摘要 |
SUMMARY |
缩略语表 |
第一章 动物细胞培养与MDCK细胞系的研究进展 |
1 动物细胞培养概述 |
1.1 动物细胞培养的发展 |
1.2 动物细胞培养的应用 |
1.2.1 基础生物学研究中的应用 |
1.2.2 动物细胞产品研发中的应用 |
1.2.3 临床医学中的应用 |
1.2.4 在基因工程研究中的应用 |
1.2.5 在环境和动物保护中的应用 |
1.3 动物细胞培养的类型 |
1.3.1 细胞培养的程序 |
1.3.2 细胞系 |
1.3.3 原代细胞系 |
1.3.4 干细胞系 |
1.3.5 细胞形态类型 |
2 MDCK细胞系特性与应用研究 |
2.1 MDCK细胞系特性 |
2.2 MDCK细胞培养 |
2.3 MDCK细胞种类 |
2.3.1 亲本MDCK(NBL-2)细胞株 |
2.3.2 MDCK Ⅰ和 MDCK Ⅱ |
2.3.3 可形成超级圆顶和超级管的细胞株 |
2.3.4 MDCK细胞作为感染模型的研究 |
2.4 MDCK细胞在流感疫苗中的应用及安全性评价 |
2.5 MDCK细胞的成瘤性 |
第二章 MDCK贴壁细胞系的培养与检定 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 试验用细胞 |
1.1.2 试剂 |
1.1.3 实验动物 |
1.1.4 仪器设备 |
1.2 方法 |
1.2.1 MDCK贴壁细胞系引进和培养 |
1.2.1.1 MDCK贴壁细胞的传代培养 |
1.2.1.2 MDCK贴壁细胞的冻存 |
1.2.2 MDCK贴壁细胞三级细胞库的建立 |
1.2.2.1 三级细胞库的活力分析 |
1.2.2.2 三级细胞库的生长曲线 |
1.2.3 主细胞库(MCB)细胞检定 |
1.2.3.2 MBC微生物污染检测 |
1.2.3.3 MBC细胞成瘤性检查 |
2 结果 |
2.1 MDCK贴壁细胞三级细胞库建立 |
2.2 三级细胞库的形态学观察 |
2.3 三级细胞库的活力分析和生长曲线 |
2.3.1 复苏细胞的活力分析 |
2.3.2 生长曲线 |
2.4 主细胞库(MCB)的细胞检定 |
2.4.1 MCB微生物污染检测 |
2.4.1.1 细菌、真菌检测结果 |
2.4.1.2 支原体检测结果 |
2.4.1.3 细胞病变外源因子检查 |
2.4.1.4 鸡胚接种法检查 |
2.4.1.5 乳鼠和成鼠接种法检查 |
2.4.2 成瘤性检查 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第三章 低成瘤性MDCK单克隆细胞系的筛选与建立 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 试验用细胞 |
1.1.2 试剂 |
1.1.3 实验动物 |
1.1.4 仪器设备 |
1.2 方法 |
1.2.1 细胞的复苏 |
1.2.2 单细胞悬液制备 |
1.2.3 单细胞培养 |
1.2.4 单克隆细胞株的筛选 |
1.2.4.1 单克隆细胞株的挑选 |
1.2.4.2 单克隆细胞株扩大培养 |
1.2.5 单克隆细胞原始细胞库的建立 |
1.2.6 单克隆细胞染色体数测定 |
1.2.7 MDCK-C09 细胞传代稳定性 |
1.2.8 单克隆细胞株的成瘤性初步检查 |
1.2.9 低成瘤性单细胞克隆株成瘤性复检 |
1.2.10 皮下(肿瘤)组织的病理学检查 |
1.2.11 皮下(肿瘤)组织的免疫组织化学检测 |
1.2.12 低成瘤性单细胞克隆株增殖流感病毒敏感性测试 |
1.2.13 低成瘤性单克隆细胞系的建立与保藏 |
2 结果 |
2.1 单克隆MDCK原始细胞库的建立 |
2.2 MDCK单克隆细胞的染色体分析 |
2.3 MDCK-C09 细胞株的传代稳定性检测 |
2.4 低成瘤性MDCK单克隆细胞的成瘤性检查 |
2.5 裸鼠皮下肿瘤的组织病理学检查结果 |
2.6 裸鼠皮下肿瘤细胞的上皮细胞标志物的免疫组化检测 |
2.7 低成瘤性单细胞克隆株增殖流感病毒的敏感性测试 |
2.8 低成瘤性单细胞克隆株细胞系的建立与保藏 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第四章 不同成瘤性MDCK细胞株差异表达基因分析 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 试验用细胞 |
1.1.2 试剂 |
1.1.3 仪器设备 |
1.2 方法 |
1.2.1 细胞的复苏 |
1.2.2 特异性文库测序实验流程 |
1.2.2.1 提取细胞中的总RNA |
1.2.2.2 RNA片段化 |
1.2.2.3 反转录合成cDNA |
1.2.2.4 接头连接 |
1.2.2.5 UNG酶消化cDNA的第二链 |
1.2.2.6 使用Illumina Hiseq平台上机测序 |
1.2.3 差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)的鉴定和功能注释 |
1.2.4 分子相互作用网络构建 |
1.2.5 网络中关键基因的RT-qPCR验证 |
1.2.5.1 细胞总RNA的提取 |
1.2.5.2 反转录成cDNA |
1.2.5.3 RT-qPCR检测基因的表达 |
1.2.5.4 与细胞测序结果进行比对 |
2 结果 |
2.1 MDCK-W与 MDCK-C细胞株之间成瘤性差异分析 |
2.2 MDCK-W与 MDCK-C细胞株之间细胞增殖相关差异分析 |
2.3 与MDCK成瘤性相关分子互作网络分析 |
2.4 与MDCK细胞增殖调控分子相互作用网络分析 |
2.5 MDCK细胞成瘤性与增殖关键基因的RT-qPCR验证结果 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第五章 低成瘤性单克隆MDCK-C09 细胞株微载体培养及生物反应器的初步应用 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 试验用细胞 |
1.1.2 试剂 |
1.1.3 材料 |
1.1.4 仪器设备 |
1.1.5 溶液配制 |
1.2 方法 |
1.2.1 Cytodex-1 载体处理方法 |
1.2.2 MDCK-C09 细胞株的复苏和扩大培养 |
1.2.3 不同培养条件对微载体培养单克隆细胞株的影响 |
1.2.3.1 硅化剂处理对培养单克隆细胞株的影响 |
1.2.3.2 细胞接种量对培养单克隆细胞株的影响 |
1.2.3.3 血清对培养单克隆细胞株的影响 |
1.2.3.4 单克隆细胞株的传代培养 |
1.2.4 单克隆细胞株在75L生物反应器中的代谢分析 |
2 结果 |
2.1 MDCK-C09 细胞株的复苏和扩大培养 |
2.2 不同培养条件对微载体培养单克隆细胞株的影响 |
2.2.1 硅化剂处理对培养单克隆细胞株的影响 |
2.2.2 细胞接种量对培养单克隆细胞株的影响 |
2.2.3 血清对培养单克隆细胞株的影响 |
2.3 单克隆细胞株的传代培养 |
2.4 单克隆细胞株在75L生物反应器中的代谢分析 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
全文总结 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
导师简介 |
(7)大肠杆菌运动调控在生物材料植入感染中的作用研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
引言 |
全文技术路线 |
第一部分应用CRISPR/Cas9技术构建大肠杆菌dgcE、dgcQ阴性突变菌株 |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二部分大肠杆菌dgcE、dgcQ在生物材料表面细菌生物膜形成中的作用 |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第三部分大鼠体内大肠杆菌的清除及生物材料表面生物膜形成的研究 |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
全文结论 |
综述 大肠杆菌运动触觉与生物材料表面生物膜形成 |
参考文献 |
个人简历 |
攻读博士学位期间所发表的论文 |
参与基金项目 |
致谢 |
(8)壳寡糖对阿尔茨海默病的作用效果评价及其机制初探(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
第1章 引言 |
1.1 阿尔茨海默病概述 |
1.2 阿尔茨海默病的发病机制 |
1.2.1 Aβ级联假说 |
1.2.2 Tau蛋白假说 |
1.2.3 胆碱能假说 |
1.2.4 氧化应激假说 |
1.2.5 微生物感染性假说 |
1.2.6 微生物-肠-脑轴假说 |
1.3 阿尔茨海默病的治疗现状 |
1.3.1 胆碱酯酶抑制剂 |
1.3.2 NMDA受体拮抗剂 |
1.3.3 靶向Aβ的治疗 |
1.3.4 靶向tau蛋白的治疗 |
1.3.5 针对神经炎症的治疗 |
1.3.6 靶向肠脑轴的治疗 |
1.3.7 天然产物在AD治疗上的应用 |
1.4 壳寡糖概述 |
1.4.1 COS的制备和分离纯化 |
1.4.2 COS及其衍生物在神经保护中的潜在应用及机制 |
1.4.3 COS的吸收和代谢 |
1.5 立题依据和研究思路 |
1.5.1 立题依据 |
1.5.2 研究内容 |
1.5.3 技术路线 |
第2章 壳寡糖的血脑屏障透过性研究 |
2.1 引言 |
2.2 实验材料和设备 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.2 实验试剂 |
2.2.3 实验设备 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 COS的制备 |
2.3.2 微流控芯片的制造与组装 |
2.3.3 基于微流控芯片的血脑屏障微系统建立 |
2.3.4 Transwell血脑屏障模型构建 |
2.3.5 表观渗透率检测 |
2.3.6 免疫荧光染色 |
2.3.7 体外模型探究COS能否透过血脑屏障 |
2.3.8 COS的荧光标记 |
2.3.9 动物活体成像验证COS能否透过血脑屏障 |
2.4 实验结果 |
2.4.1 COS的脱乙酰度 |
2.4.2 COS的聚合度分布 |
2.4.3 Transwell血脑屏障模型 |
2.4.4 微流控芯片血脑屏障模型 |
2.4.5 动物活体成像 |
2.5 小结与讨论 |
第3章 壳寡糖通过影响Aβ聚集减轻其介导的神经毒性 |
3.1 引言 |
3.2 实验材料和设备 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.2 实验试剂 |
3.2.3 实验设备 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 单一聚合度的壳寡糖的制备 |
3.3.2 Aβ42蛋白预处理 |
3.3.3 Aβ42样品制备 |
3.3.4 COS影响Aβ聚集的体系设置 |
3.3.5 ThT荧光实验 |
3.3.6 刚果红染色实验 |
3.3.7 圆二色光谱实验 |
3.3.8 透射电镜观察Aβ的聚集形态 |
3.3.9 微量热涌动仪检测COS与Aβ的互作 |
3.3.10 分子动力学模拟模型和参数 |
3.3.11 细胞培养 |
3.3.12 MTT检测细胞活力 |
3.3.13 细胞凋亡检测 |
3.3.14 氧化应激水平检测 |
3.3.15 细胞RNA提取 |
3.3.16 实时荧光定量PCR |
3.3.17 荧光染色定量分析方法 |
3.3.18 数据统计和分析 |
3.4 实验结果 |
3.4.1 COS对Aβ42的聚集抑制效果 |
3.4.2 COS对Aβ42纤维状聚体的分解作用 |
3.4.3 TEM观察COS对Aβ42聚集体形貌的影响 |
3.4.4 COS对Aβ42二级结构转化的影响 |
3.4.5 不同DP的COS对Aβ42二级结构转化的影响 |
3.4.6 不同DDA的COS对Aβ42二级结构转化的影响 |
3.4.7 COS与Aβ42的相互作用研究 |
3.4.8 不同DP的COS与Aβ42的相互作用 |
3.4.9 不同DDA的COS与Aβ42的相互作用 |
3.4.10 分子动力学模拟探究COS影响Aβ42聚集的分子机制 |
3.4.11 COS对Aβ42聚集引起的细胞毒性的影响 |
3.4.12 COS对Aβ42诱导产生的小胶质细胞功能紊乱的影响 |
3.5 小结与讨论 |
第4章 壳寡糖对AD模型小鼠认知功能的改善及其相关机制探究 |
4.1 引言 |
4.2 实验材料和设备 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 实验试剂 |
4.2.3 实验设备 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 Aβ42寡聚体制备 |
4.3.2 AD小鼠模型构建 |
4.3.3 Morris水迷宫实验 |
4.3.4 旷场实验 |
4.3.5 新物体识别实验 |
4.3.6 抗生素混合剂处理获得伪无菌小鼠 |
4.3.7 粪便菌群移植 |
4.3.8 组织样品的采集与储存 |
4.3.9 血清中和脑组织匀浆中的炎症因子检测 |
4.3.10 免疫组织化学分析 |
4.3.11 免疫荧光染色 |
4.3.12 免疫荧光染色定量分析方法 |
4.3.13 结肠组织的RNA提取 |
4.3.14 实时荧光定量PCR |
4.3.15 16S rRNA V3和V4区扩增子测序 |
4.3.16 生物信息学分析 |
4.3.17 非靶代谢组分析 |
4.3.18 统计分析 |
4.4 实验结果 |
4.4.1 AD小鼠模型构建 |
4.4.2 COS对AD小鼠行为学的影响 |
4.4.3 COS对AD小鼠脑内反应性胶质细胞增生的影响 |
4.4.4 COS对AD小鼠海马区神经元的影响 |
4.4.5 COS对AD小鼠突触功能损伤的影响 |
4.4.6 COS对AD小鼠肠道屏障完整性的影响 |
4.4.7 COS对AD小鼠肠道炎症的影响 |
4.4.8 COS对AD小鼠肠道菌群多样性的影响 |
4.4.9 COS对AD小鼠肠道菌群物种组成的影响 |
4.4.10 COS对AD小鼠肠道菌群代谢产物的影响 |
4.4.11 肠道菌群在COS治疗中的作用 |
4.5 小结与讨论 |
第5章 结论与展望 |
5.1 引言 |
5.2 研究结论 |
5.3 本论文创新点 |
5.4 工作展望 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
(9)空心金纳米棒的设计合成及其在肿瘤诊疗中的应用研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略语表 |
第一章 绪论 |
1 引言 |
2 金纳米粒子的制备与修饰 |
2.1 金纳米粒子制备 |
2.1.1 金纳米球的制备 |
2.1.2 金纳米棒的制备 |
2.1.3 金纳米壳的制备 |
2.1.4 金纳米笼/框架的制备 |
2.1.5 空心金纳米球的制备 |
2.2 金纳米粒子的表面修饰 |
2.2.1 金纳米粒子表面修饰的机制 |
2.2.2 金纳米粒子在生物医学研究中的表面修饰 |
3 金纳米粒子在生物医药中的应用 |
3.1 金纳米粒子在成像中的应用 |
3.1.1 光散射成像 |
3.1.2 荧光成像 |
3.1.3 光热成像与光声成像 |
3.1.4 CT成像 |
3.2 金纳米粒子在治疗中的应用 |
3.2.1 金纳米粒子本身作为治疗试剂 |
3.2.2 金纳米粒子作为光热治疗试剂 |
3.2.3 金纳米粒子作为递送载体 |
3.3 金纳米粒子的毒性 |
3.3.1 金纳米粒子的体外毒性与细胞摄取 |
3.3.2 金纳米粒子的体内毒性与药代动力学 |
3.3.3 金纳米粒子对环境和生态的影响 |
3.4 近红外二区响应的金纳米粒子 |
3.4.1 近红外二区诊疗的优势 |
3.4.2 近红外二区响应的金纳米粒子研究现状 |
4 课题研究思路和意义 |
第二章 长径比可调的空心金纳米棒的设计合成及其在近红外二区的诊疗应用研究 |
1 研究目的及意义 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.2 实验仪器 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 空心金纳米棒的合成 |
2.3.2 细胞实验 |
2.3.3 药物负载与释放 |
2.3.4 荷瘤裸鼠模型 |
2.3.5 体内抗肿瘤研究 |
2.3.6 多模态成像 |
2.3.7 光热转换效率 |
3 结果与讨论 |
3.1 碲纳米棒的结构表征 |
3.2 空心金纳米棒的结构表征 |
3.3 空心金纳米棒的光热性质、载药及成像研究 |
3.4 空心金纳米棒的抗肿瘤研究 |
4 结论 |
第三章 空心金纳米棒嵌合肽纳米平台在近红外二区诊疗中的应用研究 |
1 研究目的及意义 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.2 实验仪器 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 空心金纳米棒制备 |
2.3.2 嵌合肽Pp IX-PEG8-GGK(TPP)GRDEVDGC合成 |
2.3.3 !制备Au HNRs-DTPP纳米平台 |
2.3.4 Caspase-3 重新激活光敏剂 |
2.3.5 DTPP从 Au HNRs-DTPP上的释放 |
2.3.6 细胞培养 |
2.3.7 体外凋亡成像与ROS成像检测 |
2.3.8 细胞毒性检测 |
2.3.9 药代动力学 |
2.3.10 活体光热和荧光成像 |
2.3.11 活体肿瘤治疗 |
3 结果与讨论 |
3.1 Au HNRs-DTPP的表征 |
3.2 Au HNRs-DTPP的体外性能研究 |
3.3 Au HNRs-DTPP的体内性能研究 |
4 结论 |
第四章 小型化空心金纳米棒的制备及其在近红外二区诊断的应用研究 |
1 研究目的及意义 |
2 实验仪器与材料 |
2.1 实验材料 |
2.2 实验仪器 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 小型化空心金纳米棒的制备 |
2.3.2 细胞实验 |
2.3.3 荷瘤裸鼠模型 |
2.3.4 多模态成像 |
2.3.5 药代动力学和体内分布 |
2.3.6 光热转换效率 |
3 结果与讨论 |
3.1 小型化空心金纳米棒的制备 |
3.2 小型化空心金纳米棒的光热性质和光声性质 |
3.3 小型化空心金纳米棒的生物相容性 |
3.4 小型化空心金纳米棒的活体荧光成像 |
3.5 小型化空心金纳米棒的活体光声成像 |
4 结论 |
第五章 全文总结及展望 |
1 全文总结 |
2 本文创新点 |
3 本文不足 |
4 展望 |
参考文献 |
致谢 |
附录 |
1 作者简介 |
2 博士期间发表的文章 |
(10)海藻基水凝胶的制备与性能研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 前言 |
1.1 水凝胶 |
1.2 水凝胶的制备材料 |
1.2.1 透明质酸 |
1.2.2 硫酸软骨素 |
1.2.3 肝磷脂 |
1.2.4 右旋糖酐 |
1.2.5 海藻酸钠 |
1.2.6 纤维素 |
1.2.7 甲壳素和壳聚糖 |
1.2.8 明胶 |
1.2.9 丝素蛋白 |
1.2.10 白蛋白 |
1.2.11 弹性蛋白 |
1.2.12 角蛋白 |
1.2.13 工程多肽 |
1.3 水凝胶的合成方式 |
1.3.1 通过自由基聚合交联 |
1.3.2 通过点击化学交联 |
1.3.3 酚醛基氧化交联 |
1.3.4 Schiff碱交联 |
1.3.5 二硫交联 |
1.3.6 可逆Diels-Alder交联 |
1.3.7 物理交联 |
1.4 生物基聚合物水凝胶在生物医学中的应用 |
1.4.1 水凝胶支架的生物制造 |
1.4.2 药物释放 |
1.4.3 组织粘合剂和密封剂 |
1.4.4 互穿网络生物聚合物水凝胶 |
1.5 选题背景和主要研究内容 |
第二章 双金属离子交联海藻基抗冻水凝胶的制备 |
2.1 引言 |
2.2 实验部分 |
2.2.1 主要实验试剂 |
2.2.2 主要实验仪器 |
2.2.3 水凝胶的制备 |
2.2.4 水凝胶的压缩强度测试 |
2.2.5 水凝胶的拉伸强度的测试 |
2.2.6 .水凝胶的电化学性能测试 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 双金属离子交联海藻基水凝胶的制备 |
2.3.2 双金属离子交联海藻基水凝胶的抗冻性能研究 |
2.4 本章小结 |
第三章 海藻基高强度水凝胶的合成 |
3.1 引言 |
3.2 实验部分 |
3.2.1 主要实验仪器 |
3.2.2 主要实验试剂 |
3.2.3 海藻酸钠(GMA-SA)的接枝改性 |
3.2.4 水凝胶合成 |
3.2.5 水凝胶的溶胀性能测试 |
3.2.6 水凝胶压缩强度的研究 |
3.2.7 水凝胶的拉伸强度研究 |
3.2.8 水凝胶GSP-Na的电化学性能测试 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 改性海藻酸钠(GMA-SA)的合成与表征 |
3.3.2 SA-PAM半互穿网络水凝胶合成 |
3.3.3 SA-PAM水凝胶的溶胀性能 |
3.3.4 SA-PAM水凝胶压缩强度的研究 |
3.3.5 SA-PAM水凝胶的拉伸强度研究 |
3.3.6 Ca-SA-PAM全互穿网络水凝胶的合成 |
3.3.7 全互穿网络水凝胶Ca-SA-PAM的溶胀性能 |
3.3.8 Ca-SA-PAM水凝胶的抗压缩性能 |
3.3.9 Ca-SA-PAM水凝胶的抗拉伸性能研究 |
3.3.10 GMA-SA-PAM改性水凝胶的合成 |
3.3.11 GMA-SA-PAM水凝胶的溶胀性能 |
3.3.12 GMA-SA-PAM水凝胶的抗压缩性能研究 |
3.3.13 GMA-SA-PAM水凝胶的抗拉伸性能 |
3.3.14 GSP-Na导电水凝胶的溶胀性能研究 |
3.3.15 GSP-Na水凝胶的抗压缩性能 |
3.3.16 GSP-Na水凝胶的抗拉伸性能 |
3.3.17 GSP-Na水凝胶的电化学性能研究 |
3.4 本章小结 |
结论 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间已发表的相关学位论文题录 |
四、实验动物在生物技术药物生产中的应用(论文参考文献)
- [1]鸡胚模型在生物活性评价中的应用[J]. 周青青,张琼谊,余桂媛,闫昌誉,黄蓉萍,韩绍聪,李怡芳,李维熙,何蓉蓉,栗原博. 今日药学, 2021
- [2]荧光聚合物点的细胞内吞定量及活体内细胞追踪研究[D]. 袁野. 吉林大学, 2021(01)
- [3]3nm氧化铁纳米颗粒对斑马鱼胚胎发育的毒性作用机制的研究[D]. 寇瑶. 西北大学, 2021(11)
- [4]近红外二区荧光染料标记黑色素纳米探针的构建及其应用研究[D]. 蔡雯雯. 山西医科大学, 2021
- [5]应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究[D]. 李健. 吉林大学, 2021
- [6]低成瘤性MDCK单克隆细胞系的建立、成瘤性分析及应用研究[D]. 马桂兰. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [7]大肠杆菌运动调控在生物材料植入感染中的作用研究[D]. 李民杰. 昆明医科大学, 2021
- [8]壳寡糖对阿尔茨海默病的作用效果评价及其机制初探[D]. 朱立猛. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2021(01)
- [9]空心金纳米棒的设计合成及其在肿瘤诊疗中的应用研究[D]. 张微云. 华中农业大学, 2021(02)
- [10]海藻基水凝胶的制备与性能研究[D]. 刘涛. 青岛科技大学, 2021(01)