红法夫酵母发酵生产虾青素及其代谢调控研究

论文摘要

虾青素（3,3’-二羟基-β,β’-胡萝卜素-4,4’-二酮）是一种重要的类胡萝卜素,具有优良的色素沉积作用并能促进动物发育,更具有超强的抗氧化活性及较强抗肿瘤活性。由于化学合成的虾青素在应用和安全性上的局限,人们对天然来源虾青素需求量越来越大,而利用微生物（如红法夫酵母）发酵生产虾青素是当前研究的热点。红法夫酵母是唯一能利用多种碳氮源并积累虾青素为主要类胡萝卜素的酵母,本文首先采用各种物化因子对红法夫酵母原始菌株进行诱变,获得了虾青素高产突变株,研究了该突变株生产虾青素的发酵条件,建立了虾青素检测的快速方法和类胡萝卜素大规模提取方法,并进行了不同发酵规模培养条件的研究,进行了基于红法夫酵母虾青素生物合成途径的代谢调控研究。本文采用各种物化因子如紫外线（UV）、甲基磺酸乙酯（EMS）和60Coγ射线多次诱变红法夫酵母原始菌株,获得了一株稳定高产虾青素的突变株,随后在摇瓶条件下对此菌株的发酵条件进行了研究。种子、通气量、温度和pH值影响红法夫酵母生长、类胡萝卜素和虾青素的合成,种龄为48 h的种子在接种量为9%、摇床转速为250 r min–1、250 ml三角瓶装液量为30 ml、培养温度为1618℃、培养基初始pH值为5.0时有利于发酵。研究了培养基成分如碳源、氮源和无机盐对生长、类胡萝卜素和虾青素合成的影响,并对培养基成分进行了优化,最佳培养基为（g l-1）:葡萄糖30、蔗糖30、酵母浸粉6、（NH4）2SO43、KH2PO42、Na2HPO41、MgSO4 5。研究了虾青素快速和大规模提取条件,采用二甲基亚砜对湿菌体直接提取类胡萝卜素后492nm处比色测定是一种快速的虾青素近似定量方法。在优化破壁条件即50℃用4M的盐酸和6 ml的溶菌酶处理8 h,然后中和到pH值为3.0,再经喷雾干燥,用丙酮提取类胡萝卜素,提取率最高达到99. 23%。随后对红法夫酵母生物反应器间歇发酵培养工艺进行了研究,进行了5 L、100 L、2000 L、15000 L等不同规模发酵放大实验,发酵工艺研究主要在5 L全自动罐中进行。结果表明搅拌转速、通气量对溶氧、生长和产物合成有着显著影响,当搅拌速度为300 r min-1、通气量为1.5vvm时发酵结果最佳。研究了补水工艺和氧载体对发酵和溶解氧水平的影响,结果表明在大量少次补水、二甲基硅油为氧载体添加量为2%时最佳。进行的红法夫酵母15000 L规模发酵生产尚未见报道。结果表明发酵罐规模越大,发酵周期越短,推断氧的供给是红法夫酵母发酵产虾青素的一个重要影响因子。基于红法夫酵母虾青素生物合成途径下,研究了不同代谢中间产物如番茄红素、胡萝卜素、柠檬酸钠、谷氨酸钠、乙醇等物质对于红法夫酵母生长、类胡萝卜素和虾青素合成的影响,它们在一定浓度下对红法夫酵母的生长、类胡萝卜素和虾青素合成都有促进作用。研究了真菌、化学诱导子对红法夫酵母生长、类胡萝卜素和虾青素合成的影响,将由Rhodotorula rubra、Rhodotorula glutinis、Panus conchatus、Coriolus versicolor、Mucor mucedo和Mortieralla alpina制备的真菌诱导子和用氯化镉、二氧化钛制备的化学诱导子以不同的浓度添加到发酵培养基中,结果表明一定浓度下真菌诱导子对红法夫酵母的生长、类胡萝卜素和虾青素合成有促进作用,在较高添加浓度下生物量、类胡萝卜素产量和虾青素产量比对照高,而在较低浓度下类胡萝卜素和虾青素含量比对照高。化学诱导子对生长有一定的抑制作用,而类胡萝卜素和虾青素产量相对对照有较大提高。在添加P. conchatus、C. Versicolor、氯化镉和二氧化钛诱导子后,诱导产生的红法夫酵母胞内活性氧含量随时间而升高,在诱导后2440 h时胞内活性氧含量最高,如二氧化钛和氯化镉在诱导后第40 h胞内活性氧均达到最高值,分别为299和286 nmol g-1 FCW（fresh cell weight,湿菌体重量）,证明胞内活性氧对于虾青素合成的确有促进作用,推断活性氧激活了虾青素生物合成途径中相关酶或基因表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 类胡萝卜素
• 1.2 虾青素
• 1.3 红法夫酵母与虾青素
• 1.4 红法夫酵母虾青素生物合成途径、相关酶及分子生物学研究
• 1.5 红法夫酵母发酵工艺条件研究现状
• 1.6 红法夫酵母发酵过程研究
• 1.7 本文研究内容
• 2 红法夫酵母高产菌株的选育及其发酵条件研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.3 本章小结
• 3 红法夫酵母生物反应器大规模培养工艺研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.3 本章小结
• 4 基于红法夫酵母虾青素生物合成途径的调控研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.3 本章小结
• 5 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 本论文创新之处
• 5.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录一 攻读博士学位期间发表论文
• 附录二 大规模发酵中试车间现场及结果