论文摘要
目的:本实验分三个部分:1建立大鼠肝脏原位加体外循环胶原酶灌注、Percoll密度梯度离心法分离与培养肝窦内皮细胞,观察Akt蛋白及NF-кB在肝切除术后肝窦内皮细胞中的表达。2观察PI3K/Akt对肝窦内皮细胞分泌HGF、IL-6、NO和NOS等细胞因子功能的影响。3通过观察PI3K/Akt对肝窦内皮细胞DNA合成及细胞周期的影响来探讨它对肝部分切除术后可能通过启动和促进肝窦内皮细胞各项功能,从而在肝再生发生中起到重要的作用。材料和方法第一部分:Sprague-Dawley大鼠,雄性,体重在190-210g,平均体重200±3.5g,由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。CollagenaseⅣ、GBSS、购自美国Sigma公司,胶原酶S、胶原酶Ⅳ、DnaseⅠ、表皮生长因子（EGF,Cat.NO.1033476）。Percoll购自美国Pharmacia公司,CD14多抗（美国Santa cruz）。CS-15高速冷冻离心机（美国Beckman公司）。Akt单抗购自美国Santa Craz公司,LY294002购自美国Promega公司。采用Higgins & Aderson创建的经典大鼠肝部分切除术模型,即分别于肝左叶、中叶根部结扎切除。计算大鼠肝切除率,在术后0h、6h、24h、48h、72h五个不同的时相点,分离肝窦内皮细胞。HSEC分离方法采用肝脏原位匀速加离体循环胶原酶灌注、percoll密度梯度离心方法,得到HSEC沉淀,细胞计数,调整细胞浓度为（1.2-1.5）×106/ml,经37oC,5%CO2孵育20分钟,待细胞选择性贴壁后,收集未贴壁的细胞悬液,培养于24孔板（内置有胶原包被的盖玻片）,孵箱培养5小时后更换培养液,此后每两天换液一次。通过台盼蓝染色判断测定细胞活性,CD14多抗免疫细胞化学染色及用扫描电镜观察超微结构鉴定HSEC。细胞培养24小时后,裂解细胞提取胞浆蛋白,作Western blot观察HSEC中Akt蛋白、磷酸化Akt及NF-кB的表达。第二部分:实验动物同第一部份,NO和NOS检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;大鼠HGF和IL-6 ELISA KIT购自美国TPI公司;百乐405型酶标仪;Pharmacia
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