柑橘采后病害拮抗菌柠檬形克勒克酵母34-9诱变改良研究

论文摘要

菌株34-9（Kloeckera apiculata）是本实验室从柑橘园根际土壤中分离获得的1株生防酵母菌,该菌对柑橘青、绿霉病菌具有较强的拮抗作用,但在后续研究中发现该菌株存在不易干燥、抑菌谱窄等问题,其抑菌活性还有待提高。因此,为开发出能代替化学药剂的安全无毒生防制剂奠定基础,并为下一步运用基因工程对拈抗酵母菌进行遗传改造提供试验材料,有必要对其进行诱变改良,以期获得能够防治柑橘采后病害的多功能酵母菌。本研究以34-9为出发菌株,通过紫外线（UV）、UV+LiCl、微波辐射、60Coγ射线等诱变处理,分析了各种诱变因子对34-9的诱变效应,明确了各诱变因子的最佳诱变剂量和最佳诱变时间,用离体和活体筛选相结合的方法从随机挑选的突变株中筛选出4株高效突变菌株。同时对诱变菌株γ-60-11在离体条件下的生长特性、抑菌谱及培养条件进行了初步研究。主要研究结果如下:1采用UV、UV+LiCl对34-9进行诱变改良,处理的最佳剂量为UV处理15w 30cm照射20s,UV+LiCl处理UV照射20s并在平板中加入LiCl0.3%（w/v）,选育到1株生理特性有明显改善的变异菌株UV20-13,果实试验中,7d后柑橘青、绿霉病的发病率分别比出发菌株降低25.56%和10.00%;采用微波辐照,辐照的最佳时间为50s,选育到1株在活体试验7d后,柑橘青霉病的发病率比出发菌株降低10.43%的拮抗菌株W50-56,选育到1株在果实试验7d后,柑橘绿霉病的发病率比出发菌株降低10.62%的拮抗菌株W50-47;采用60Coγ射线处理,辐射的最佳剂量为600Gy,选育到1株生理特性有明显改善的变异菌株γ-60-11,果实试验中,7d后柑橘青、绿霉病的发病率分别比出发菌株降低12.82%和12.46%。所选育的菌株经多次传代,遗传性状十分稳定。2对γ-60-11生长特性的研究发现,γ-60-11与34-9相比细胞个体变小,细胞形态大部分变为椭圆形或卵圆形,少部分仍为柠檬形;在豆芽汁培养基上γ-60-11菌落都很小,而34-9的菌落都较大;生长动态比较发现γ-60-11与34-9生长趋势基本一致,但γ-60-11在各个时期的生物量都低于34-9。3研究了γ-60-11的抑菌谱:本研究从真菌中选择了11种常见的果树病原真菌作为靶标菌,以测定诱变所得菌株的抑菌谱。从作用效果来看,γ-60-11的抑菌谱比出发菌株34-9变宽,γ-60-11能对34-9没有嗜杀作用的柑橘酸腐病、芒果蒂腐病、葡萄灰霉病、葡萄根霉病有一定的拮抗作用,对其他7种靶标菌二者都有拮抗效果,但γ-60-11作用效果优于34-9。4研究了γ-60-11摇瓶发酵的最佳培养条件:对摇瓶装量（通气量）、发酵时间、初始pH值和接种量进行了正交试验,找出了他们的最佳组合;对摇床转速、培养温度两个参数的研究发现:在一定的时间内,摇床转速越高,γ-60-11的生物量就明显增高;γ-60-11适宜的发酵温度为28℃。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 国内外柑橘生产概况
• 1.2 国内外柑橘采后病害生物防治研究
• 1.3 微生物诱变育种的应用情况
• 1.3.1 提高有效产物的产量
• 1.3.2 改善菌种特性、提高产品质量
• 1.3.3 简化工艺条件
• 1.3.4 开发新品种
• 1.4 微生物诱变育种的方法
• 1.4.1 物理因子诱变
• 1.4.2 化学因子诱变
• 1.4.3 复合因子诱变
• 1.5 微生物诱变育种新技术研究进展
• 1.5.1 激光辐照诱变育种
• 1.5.2 离子束注入诱变育种
• 1.5.3 微波辐射诱变育种
• 1.5.4 空间诱变育种
• 1.6 选题的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 供试果实
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌悬液的制备
• 2.2.2.诱变方法
• 2.2.2.1 紫外诱变
• 2.2.2.2 紫外线+LiCl
• 2.2.2.3 微波处理
• 60Coγ射线处理'>2.2.2.4⁶⁰Coγ射线处理
• 2.2.3 理想菌株的筛选
• 2.2.3.1 初筛
• 2.2.3.2 复筛
• 摇瓶复筛
• 活体（in vivo）复筛
• 2.2.4 遗传稳定性测定
• 2.2.5 γ-60-11抑菌谱测定
• 2.2.6 γ-60-11生长特性研究
• 2.2.6.1 γ-60-11细胞形态的变化
• 2.2.6.2 γ-60-11与菌落形态的变化
• 2.2.6.3 γ-60-11生长动态的变化
• 2.2.7 γ-60-11培养条件研究
• 2.2.7.1 γ-60-11在不同培养基上生长情况
• 2.2.7.2 碳源改良
• 2.2.7.3 氮源改良
• 2.2.7.4 摇瓶条件优化
• 2.2.7.5 不同摇床转速试验
• 2.2.7.6 不同温度试验
• 2.2.8 统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 紫外及紫外+LiCl诱变结果
• 3.1.1 诱变剂量的确定
• 3.1.2 初筛
• 3.1.3 复筛
• 3.1.3.1 摇瓶复筛
• 3.1.3.2 活体（in vivo）复筛
• 3.1.4 UV20-13菌株遗传稳定性
• 3.2 微波诱变结果
• 3.2.1 微波处理的致死效应
• 3.2.2 微波诱变效果
• 3.2.3 初筛
• 3.2.4 复筛
• 3.2.4.1 摇瓶复筛
• 3.2.4.2 活体（in vivo）复筛
• 3.2.5 突变株遗传稳定性
• 60Coγ射线诱变结果'>3.3⁶⁰Coγ射线诱变结果
• 60Coγ射线诱变的致死效应'>3.3.1⁶⁰Coγ射线诱变的致死效应
• 60Coγ射线诱变效果'>3.3.2⁶⁰Coγ射线诱变效果
• 3.3.3 初筛
• 3.3.4 复筛
• 3.3.4.1 摇瓶复筛
• 3.3.4.2 活体（in vivo）复筛
• 3.3.5 突变株遗传稳定性
• 3.4 γ-60-11抑菌谱测定
• 3.5 γ-60-11生长特性研究
• 3.5.1 γ-60-11细胞形态的变化
• 3.5.2 γ-60-11菌落形态的变化
• 3.5.3 γ-60-11生长动态的变化
• 3.6 γ-60-11培养条件优化
• 3.6.1 γ-60-11在不同培养基上生长情况
• 3.6.2 碳源改良
• 3.6.3 氮源改良
• 3.6.4 摇瓶条件优化
• 3.6.5 不同摇床转速试验
• 3.6.6 不同温度试验
• 4 讨论
• 4.1 出发菌株的诱变
• 4.2 理想突变菌株的筛选
• 4.3 理想突变菌株生物学特性及发酵条件
• 下一步研究计划
• 参考文献
• 论文及成果
• 致谢
• 附图及说明